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Titel: Einfluss des Nipahvirus-Matrixproteins auf die Lokalisation von viralen Nukleokapsiden und inclusion bodies
Autor: Ringel, Marc
Weitere Beteiligte: Maisner, Andrea (Prof. Dr.)
Veröffentlicht: 2017
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2017/0603
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2017-06033
DOI: https://doi.org/10.17192/z2017.0603
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): Influence of Nipah virus matrix protein on the localization of viral nuclocapsids and inclusion bodies
Publikationsdatum: 2018-05-07
Lizenz: https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0

Dokument

Schlagwörter:
Nukleokapside, assembly, matrixprotein, nucloecapside, transport, Zytoskelett, Nipahvirus, Matrixprotein, trafficking, Transport, Nipah virus, Assembly

Zusammenfassung:
Zusammenfassung Das Nipahvirus (NiV) ist ein hochpathogenes, BSL-4 klassifiziertes Paramyxovirus. Das Hüll-assoziierte Matrixprotein (NiV-M) spielt eine zentrale Rolle beim Virus-Assembly und der Bildung infektiöser Viruspartikel, weil es den Kontakt zwischen den im Zytoplasma gebildeten Nukleokapsiden (RNPs) und den NiV-Oberflächen-Glykoproteinen vermittelt. Um diese wichtige Funktion zu erfüllen, muss das NiV-M an die Plasmamembran gelangen, wobei es in einigen Zelltypen vorher durch den Zellkern transportiert wird. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte mit Hilfe verschiedener Kernimport- und Kernexport-Mutanten und Immunfluoreszenzanalysen in fixierten und lebenden Zellen gezeigt werden, dass das NiV-M auch in Zelltypen, in denen es bislang nicht im Zellkern nachweisbar war, einen Kerntransit durchlaufen muss, bevor es an die Plasmamembran transportiert wird. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht, wo und wie das NiV-M mit viralen RNPs interagiert. Erste Untersuchungen hatten gezeigt, dass virale RNPs in infizierten Zellen in großen zytoplasmatischen inclusion bodies (IB) akkumulieren. Diese liegen teilweise perinukleär und teilweise an der Plasmamembran vor, wo letztendlich das Virus-Assembly stattfindet. Um zu klären, ob das NiV-M beim Transport der RNPs an die Plasmamembran und für die Bildung der unterschiedlich lokalisierten IB eine Rolle spielt, wurde der Einfluss des NiV-Ms auf die IB-Verteilung untersucht. Sowohl Infektions- als auch Kotransfektionsstudien zeigten, dass für die Bildung von peripheren IB an der Plasmamembran und das Virus-Assembly die Expression von funktionellem, korrekt durch den Kern transportiertem NiV-M essentiell ist. Transport-defekte NiV-M Mutanten oder fremde Matrixproteine wie z.B. von Masern- oder Ebolaviren, konnten keine IB-Bildung an der Plasmamembran induzieren. Sie kolokalisierten allerdings mit perinukleären IB, was vermuten lässt, dass diese ein eigenes zelluläres Kompartiment bilden, das stark exprimierte, zytosolische Proteine rekrutieren kann. Die IB an der Plasmamembran bilden sich unabhängig davon, wenn funktionelles NiV-M vorhanden ist. Die Vermutung, dass sich perinukleäre und periphere IB prinzipiell unterscheiden, konnte auch auf ultrastruktureller Ebene durch elektronenmikroskopische Studien bestätigt werden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde durch Studien mit verschiedenen Zytoskelett-Inhibitoren gezeigt, dass eine Zerstörung der Aktinfilamente durch Cytochalasin D den M-Transport und die IB-Bildung an der Plasmamembran verhindern kann. Dies lässt vermuten, dass das Aktinzytoskelett aber nicht die Mikrotubuli eine wesentliche Rolle für das NiV-M vermittelte Virus-Assembly spielen. Insgesamt konnten in dieser Arbeit neue grundlegende Kenntnisse über den intrazellulären Transport des NiV-Ms und die Entstehung von Plasmamembran-assoziierten inclusion bodies gewonnen werden, beides essentielle Voraussetzungen für eine effiziente Neubildung und Freisetzung infektiöser Nipahviren.

Summary:
Summary Nipah virus (NiV) is a biosafety level 4 (BSL-4) classified paramyxovirus. The NiV matrix protein (NiV-M) plays a major role in virus assembly and is indispensable for the production of infectious viral particles because it mediates the contact between cytosolic viral nucleocapsids (RNPs) and the NiV surface glycoproteins. To fulfil its important functions, NiV-M must be transported to the plasma membrane. In some cell types, NiV-M surface trafficking is known to be preceded by a transport through the nucleus. In the first part of this thesis, nuclear import and export NiV-M mutants were characterized by immunofluorescence analyses in fixed and living cells. This study revealed that a nuclear transit of NiV-M is principally required for a successful plasma membrane transport, even in cell types in which nuclear NiV-M cannot be detected in steady state analyses. The second part of this thesis addressed the question, where and how NiV-M interacts with viral RNPs. First studies in infected cells had shown that viral RNPs accumulated in large cytoplasmic inclusion bodies (IB). These were either located perinuclearly or were closely associated with the plasma membrane, where the virus assembly occurs. To determine, if NiV-M plays a role in RNP transport to the plasma membrane and in the formation of the two differently located IB, the influence of NiV-M on the localization of IB was analyzed. Both, infection and cotransfection studies showed that correct nuclear trafficking and subsequent surface targeting of NiV-M was essentially needed for the formation of IB at the plasma membrane and for virus assembly. Transport-defect NiV-M mutants and matrix proteins of other viruses such as measles or Ebola viruses, could not support the formation of plasma membrane associated IB. However, these non-functional M proteins colocalized with perinuclear IB suggesting that perinuclear IB represent a separate cellular compartment that recruits abundantly expressed cytosolic proteins. IB at the plasma membrane are formed independently if functional NiV-M is present. This idea of two separate IB types was also supported by electron-microscopic studies revealing that perinuclear and peripheral IB differed ultrastructurally. In the last part of this thesis, studies with different cytoskeleton inhibitors revealed that actin disruption by Cytochalasin D efficiently prevented M transport and IB accumulation at the plasma membrane. This indicates that actin filaments rather than mircotubuli play an essential role in the NiV-M mediated virus assembly. Altogether, this thesis provides new fundamental knowledge about the intracellular transport of NiV-M and the formation of plasma membrane associated inclusion bodies, both essential prerequisites for efficient assembly and release of infectious Nipah viruses.


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