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Titel: Beyond Affinity: Drug-Kinase Interaction Put under the Microscope
Autor: Wienen-Schmidt, Barbara
Weitere Beteiligte: Klebe, Gerhard (Prof.)
Veröffentlicht: 2017
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2017/0537
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2017-05379
DOI: https://doi.org/10.17192/z2017.0537
DDC: Pharmacology & therapeutics, prescription drugs
Titel(trans.): Mehr als nur Affinität: Wirkstoff-Kinase Wechselwirkungen unter der Lupe
Publikationsdatum: 2018-04-05
Lizenz: https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0

Dokument

Schlagwörter:
NMR, isothermal titration calorimetry (ITC), Protein Kinase A (PKA), X-ray Crystallography, 15N-, Inhibitor, Röntgenstrukturanalyse, Röntgenstrukturanalyse, Thermodynamik, isotherme Titrationskalorimetrie (ITC), Enthalpie, Thermodynamik, Inhibition, NMR, Selektivität, Freiheitsgrad, Kinases, Dynamik, Dynamics, Fasudil, Protein Kinase A (PKA), Kinase, Thermodynamics, Inhibition, 15, Fasudil, Entropie

Summary:
Over the last 20 years, the consideration of biophysical parameters such as kinetics and thermodynamics has been used to guide modern drug design. In contrast to the classical approach that mainly relies on affinity optimization, biophysical parameters allow a further discrimination of potential drug candidates with comparably high affinity. However, there is still a lack of systematic studies analyzing the impact of chemical ligand structure on, for example, thermodynamics. The studies presented in this thesis aim to bridge this gap. In this thesis a model protein, namely cAMP-dependent protein kinase (PKA) is used to gain particular insights into kinase behavior and thermodynamics upon ligand binding. Due to their implication in various diseases such as cancer, kinases are of utmost importance in drug design. The ligands used in this study were derived from the approved drug fasudil. They differ in their ligand degrees of freedom, molecular weight and decorations. Analyzing the impact of ligand degrees of freedom on the thermodynamic signatures, crystal structures were determined. The crystallographic analysis confirmed the flexible nature of the kinase. Particularly the position of the Gly-rich loop differs in the complex structures of ligands with varying ligand degrees of freedom. Thermodynamic signatures were determined using isothermal titration calorimetry. Remarkably, the ligand with the largest amount of internal degrees of freedom appeared to be the binder with the most beneficial entropic contribution. This counterintuitive observation is most likely the result of water displacement from the active site upon ligand binding and due to a higher ordered local water structure of the ligand in solution prior to protein binding. For the series of ligands with increasing molecular weight, differences in the ligand coordination with the protein could be observed. A clear trend toward a more entropic and less enthalpic binding upon increasing molecular weight could be observed. Again, this results from structural changes and probably from the state of the uncomplexed ligand in solution, an utterly underestimated factor. For ligand decoration, introduction of methyl groups is a simple but potentially powerful approach. For differentely methylated ligands not only position but also stereochemistry of the methyl group has an influence on binding potency as well as the thermodynamic signature of ligand binding. Strikingly, the combination of single methyl groups does not lead to additive effects, neither in the binding mode visible in the crystal structure nor in the thermodynamic profile. Further decorations and fragments of fasudil and adenosine triphosphate (ATP) were crystallographically analyzed focusing on their interaction with the hinge region of PKA. It is a key point of attack of ATP-competitive kinase inhibitors. Even minor changes in chemical ligand or fragment structure, result in severe changes of the hinge binding pose of the respective binders. A kinase screen testing 16 ligands against 39 different kinases was performed in order to evaluate if thermodynamic properties can be correlated to the selectivity profile of a potential drug. Especially for kinases, selectivity is challenging but of utmost importance. Remarkably, only ΔG correlated well with the determined selectivity profiles. Finally a methodology approach is presented comparing results from soaking and co-crystallization protocols. The results suggest that structural data from soaking experiments should ideally be verified by cocrystallization, since strong differences between the structures could be observed. There is still a lack of systematical studies correlating structural data, biophysical parameters and selectivity profiles of closely related ligand series. This is the only way to understand the interplay of these different factors, and only then biophysical parameters exceeding affinity information can reveal their full potential and predictive power for the selection of drug candidates.

Zusammenfassung:
Seit rund 20 Jahren werden biophysikalische Parameter aus Thermodynamik und Kinetik immer häufiger verwendet, um die moderne Wirkstoffforschung zu verbessern. Im Gegensatz zum klassischen Wirkstoffdesign bei dem nach Affinitäten priorisiert wird, erlauben biophysikalische Methoden potentielle Wirkstoffkandidaten weitergehend zu differenzieren, auch wenn sie gleiche Affinitäten aufweisen. Leider werden mehr systematische Studien benötigt, die den Einfluss der chemischen Ligandstrukturen auf z.B. Thermodynamik untersuchen. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab diese bestehende Lücke zu verkleinern. In dieser Arbeit wird die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) als Modellprotein verwendet um Details über das Verhalten von Kinasen und der Thermodynamik bei der Ligandbindung zu untersuchen. Da Kinasen eine wichtige Rolle in verschiedensten Krankheiten spielen (z.B. Krebs), sind sie von höchster Wichtigkeit in der Wirkstoffentwicklung. Die Liganden die in dieser Studie verwendet werden sind von dem zugelassenen Wirkstoff Fasudil abgeleitet. Sie unterscheiden sich von Fasudil in ihrem Molekulargewicht, der Anzahl ihrer Freiheitsgrade oder durch zusätzliche kleinere Substituenten. Um die Relevanz von Liganden Freiheitsgraden auf die thermodynamischen Profile bei der Protein-Ligand Bindung zu untersuchen, wurden Kristallstrukturen dieser Komplexe bestimmt. Die Kristallstrukturanalyse bestätigte die bereits bekannte strukturelle Flexibilität der Proteinkinase. Insbesondere die Gly-reiche Schleife zeigt in allen Kristallstrukturen eine gesonderte räumliche Position. Die thermodynamischen Signaturen wurden mit Hilfe der isothermen Titrationskalorimetrie gemessen. Bemerkenswerterweise zeigt der Ligand mit den meisten intrinsischen Freiheitsgraden, die entropisch vorteilhafteste Bindung an PKA. Dieses kontraintuitive Ergebnis ist vermutlich auf eine höher geordnete lokale Wasserstruktur des Liganden vor der Bindung, in Lösung, zurückzuführen. Für die Serie, die auf Liganden mit zunehmendem Molekulargewicht fokussiert ist, konnten Unterschiede in der Koordination des Liganden mit dem Protein beobachtet werden. Dabei zeigte sich in den thermodynamischen Profilen ein klarer Trend, bei dem mit zunehmendem Molekulargewicht der entropische Bindungsbeitrag stieg, während der enthalpische Bindungsbeitrag sank. Der Grund hierfür ist vermutlich ebenfalls der Zustand des Liganden in Lösung, ein Faktor der leider häufig unbeachtet bleibt. Methylgruppen sind einfache Substituenten, die dennoch eine große Wirkung haben können. Bei der Untersuchung von Liganden mit zusätzlichen Methylgruppen in verschiedenen Positionen stellte sich heraus, dass diese nicht nur einen Einfluss auf die Affinität sondern auch auf die thermodynamischen Signaturen haben. Interessanterweise hat die Kombination von verschiedenen Methylgruppen keinen additiven Effekt, weder bezüglich der Thermodynamik noch bezüglich des Bindemodus in der Kristallstruktur. Andere Substituenten und Fragmente von Fasudil und Adenosintriphosphat (ATP) wurden kristallographisch auf ihre Interaktion mit der Scharnierregion der PKA untersucht. Die Scharnierregion ist der wichtigste Angriffspunkt für ATP-kompetitive Hemmstoffe. Kleinste Änderungen der chemischen Ligandstruktur führten zu starken Änderungen der Bindeposition und veränderten Interaktionen mit der Scharnierregion. Zur abschließenden Analyse wurde außerdem eine Kinase-Selektivitätsuntersuchung mit 39 Kinasen und 16 Liganden durchgeführt. Die so erhaltenen Selektivitätsprofile wurden dann auf eine mögliche Korrelation mit den thermodynamischen Daten hin überprüft. Für Kinaseinhibitoren ist eine hohe Selektivität einer der herausforderndsten und wichtigsten Parameter. Bei der Analyse zeigte sich, dass ausschließlich ΔG gut mit den Selektivitätsprofilen korreliert. Des Weiteren wird in der Arbeit noch eine Methodenuntersuchung diskutiert, bei der Cokristallisation mit der sogenannten „soaking“ (engl. Durchtränken) Methode verglichen wird. Dabei konnten signifikante Unterschiede zwischen den resultierenden Kristallstrukturen beobachtet werden. Dies weist darauf hin, dass Ergebnisse aus „soaking“ Experimenten idealerweise durch Cokristallisation bestätigt werden sollten. Der Bedarf an weiteren systematischen Studien, die das Zusammenspiel von Struktur, biophysikalischen Daten und Selektivitätsprofilen von Ligandenserien untersuchen, ist nach wie vor hoch. Solche Daten sind die notwendige Voraussetzung um die Abhängigkeiten dieser Parameter voneinander zu verstehen. Nur so können biophysikalische Parameter wirklich zielgerichtet und gewinnbringend eingesetzt werden um verlässliche Vorhersagen über die Auswahl von potentiellen Wirkstoffkandidaten zu treffen.


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