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Titel: Phylogenetic, biochemical and structural assessment of key enzymes in ectoine and hydroxyectoine biosynthesis
Autor: Widderich, Nils
Weitere Beteiligte: Bremer, Erhard (Prof. Dr.)
Veröffentlicht: 2017
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2017/0515
DOI: https://doi.org/10.17192/z2017.0515
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2017-05155
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Phylogenetische, biochemische und strukturelle Analysen der Schlüsselenzyme in der Ectoin- und Hydroxyectoin-Biosynthese
Publikationsdatum: 2018-02-28
Lizenz: https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0

Dokument

Schlagwörter:
Ectoin, Biochemie, Genetik, Kompatible Solute, Biologie, Mikrobiologie, Life Scienc, Biowissenschaften, Enzym, Bakterien, compatible solutes

Summary:
In their natural habitats, microorganisms have to frequently cope with a multitude of stressful biotic and abiotic conditions that can have adverse effects on their growth and their survival in a given ecosystem. One of the most important parameters of environmental stress due to its impact on almost all microorganisms is changing osmolarity/salinity. Among microorganisms, accumulation of compatible solutes is a widely used strategy to preserve cell integrity and growth under hyperosmotic conditions. The tetrahydropyrimidines ectoine and hydroxyectoine belong to these osmolytes and are produced by many procaryotes to minimize the adverse effects of high osmolarity on cellular physiology. Due to their beneficial impact on macromolecules, ectoine and hydroxyectoine are also reffered to in literature as chemical chaperones. These properties have spurred considerable biotechnological interest in ectoines. Ectoine is enzymatically synthesized by the ectoine synthase (EctC) and the ectoine hydroxylase (EctD) catalyses the conversion of ectoine to hydroxyectoine. Despite the fact that both enzymes have already been studied somewhat, in-depth knowledge on their phylogenetic distribution, biochemistry and structure was still lacking prior to this dissertation since only a minor number of EctC and EctD proteins has been characterized and crystal structures of both proteins containing all ligands were still missing. Since a deeper understanding of these key enzymes in ectoine biosynthesis is desirable, both with respect to basic science and industrial applications, the aim of the present dissertation was to assess the phylogenetic affiliation of ectoine biosynthetic genes and to study a selection of EctC and EctD enzymes with respect to their biochemical and kinetic properties. In addition, crystallographic approaches of EctC and EctD and site-directed mutagenesis experiments of EctD were conducted to provide a basis to unravel the position and binding motifs of the ligands within the catalytic cores of EctC and EctD. To elucidate the phylogenetic distribution of ectoine biosynthesis, the amino acid sequences of both key enzymes were used as a search query and identified, after removal of redundant sequences, about 723 potential ectoine producers of which only 12 originated from Archaea. This analysis revealed that ectoine biosynthesis is widely distributed in prokaryotes, predominantly in members of the Bacteria, underlining the important role of ectoines in microbial stress responses. On this basis, various ectoine synthases and ectoine hydroxylases deriving from different organisms have been biochemically and/or kinetically characterized that were widely distributed on the phylogenetic tree of ectoine biosynthesis. Each of the so far studied proteins possessed similar enzyme kinetics, however, comparison of their biochemical characteristics revealed only minor differences between EctD proteins but major variations between EctC enzymes. This suggests that the ectoine synthase, whose properties partially reflect the environmental circumstances of their hosts, might have developed in terms of evolution prior to the ectoine hydroxylase. Identification of EctC and EctD proteins possessing increased stability allowed new crystallization trials. Multiple crystal structures have been solved in the course of this dissertation in collaboration with Dr. Sander Smits (University of Düsseldorf). In terms of EctD, structures in its apo-form, in complex with the iron co-factor and in complex with the iron catalyst, the co-substrate 2-oxoglutarate and the reaction product hydroxyectoine have been solved. These structures provided, in connection with comprehensive site-directed mutagenesis experiments, a detailed view into the catalytic core of EctD allowing a proposal for its catalyzed reaction mechanisms (Proposal by Dr. Wolfgang Buckel). In terms of EctC, a detailed expression and purification protocol for the ectoine synthase from the cold-adapted marine bacterium Sphingopyxis alaskensis has been described in collaboration with Dr. Sander Smits (University of Düsseldorf) that identifies EctC to form dimers in solution and deals with crystallization trials and preliminary X-ray diffraction data providing a promising basis for the solution of its crystal structure, which has, based on the presented data, been published posterior to the present dissertation. Collectively, the present dissertation provides detailed information about the phylogenetic distribution and biochemistry of EctC and EctD as well as the solved crystal structure of the ectoine hydroxylase, the key enzymes in hydroxyectoine biosynthesis, and promising crystallization trials of EctC, the key enzyme in ectoine biosynthesis, and thus substantially contributes to the understanding of the role of ectoines in the global microbial osmostress adaptation.

Zusammenfassung:
In ihren natürlichen Habitaten müssen Mikroorganismen regelmäßig eine Vielzahl biotischer und abiotischer Stressbedingungen, welche beeinträchtigende Effekte auf ihr Wachstum und ihr Überleben in einem gegebenen Ökosystem haben können, bewältigen. Aufgrund ihres Einflusses auf nahezu alle Mikroorganismen ist wechselnde Osmolarität/Salinität einer der wichtigsten durch die Umwelt bedingten Stressfaktoren. Unter Mikroorganismen ist die Akkumulation von kompatiblen Soluten eine weitverbreitete Anpassungsstrategie um die Zellintegrität und das Wachstum unter hyperosmotischen Bedingungen zu wahren. Die Tetrahydropyrimidine Ectoin und Hydroxyectoin sind solche Osmolyte und werden von vielen Prokaryoten synthetisiert um die beeinträchtigenden Auswirkungen hoher Osmolarität auf die zelluläre Physiologie zu minimieren. Aufgrund ihres positiven Einflusses auf Makromoleküle werden Ectoin und Hydroxyectoin in der Literatur auch als chemische Chaperone bezeichnet. Diese Eigenschaften haben Ectoine bereits für biotechnologische Anwendungsgebiete interessant gemacht. Ectoin wird enzymatisch durch die Ectoin-Synthase (EctC) synthetisiert und die Ectoin-Hydroxylase (EctD) katalysiert die Umwandlung von Ectoin zu Hydroxyectoin. Obwohl beide Enzyme bereits einigen wenigen Studien unterzogen wurden mangelt es an Detailwissen hinsichtlich ihrer phylogenetischen Verbreitung, Biochemie und Struktur, da nur eine kleine Zahl von EctC- und EctD-Proteinen vor dieser Dissertation charakterisiert wurde und Kristallstrukturen beider Proteine mitsamt aller gebunden Liganden noch immer fehlten. Da ein vertieftes Verständnis dieser Schlüsselenzyme in der Ectoin-Biosynthese sowohl hinsichtlich Grundlagenforschung als auch mit Blick auf deren industrieller Anwendungsbereiche erstrebenswert ist, war das Ziel der vorliegenden Dissertation die phylogenetische Verbreitung der Ectoin-Biosynthesegene zu taxieren und eine Selektion von EctC- und EctD-Enzymen hinsichtlich ihrer biochemischen und kinetischen Parameter zu studieren. Zusätzlich wurden von beiden Proteinen kristallographische Studien durchgeführt, um die Position und Bindemotive der verschiedenen Liganden in den katalytischen Zentren von EctC und EctD zu entschlüsseln. Diese wurden im Falle von EctD mittels gerichteter Mutagenese-Experimenten unterstützt. Um die phylogenetische Verbreitung der Ectoin-Biosynthese aufzuklären wurden die Aminosäure-Sequenzen beider Proteine als Suchanfrage genutzt, wodurch, nach Aussortierung redundanter Sequenzen, 723 potentielle Ectoin-Produzenten identifiziert werden konnten, von welchen lediglich 12 aus Archaeen stammten. Diese Analyse zeigte, dass die Ectoin-Biosynthese unter den Prokaryoten, und dabei überwiegend unter den Bakterien, weit verbreitet ist. Somit konnte die wichtige Rolle der Ectoine in der mikrobiellen Stressantwort unterstrichen werden. Auf dieser Grundlage wurden verschiedene Ectoin-Synthasen und Ectoin-Hydroxylasen, welche aus unterschiedlichen Organismen stammten und auf dem phylogenetischen Ectoin-Biosynthese Stammbaum weit verbreitet waren, biochemisch und/oder kinetisch charakterisiert. Jedes der studierten Enzyme wies ähnliche Enzymkinetiken auf, der Vergleich ihrer biochemischen Charakteristika offenbarte jedoch geringfügige Unterschiede zwischen den EctD-Proteinen und signifikantere Unterschiede innerhalb der EctC-Enzyme. Dies suggeriert, dass sich die Ectoin-Synthase, deren Eigenschaften partiell die Umweltbedingungen ihrer Wirte reflektiert, evolutionär vor der Ectoin-Hydroxylase entwickelt haben könnte. Die Identifizierung von EctC- und EctD-Proteinen, welche vergleichsweise erhöhte Stabilität aufwiesen, erlaubte zudem neue Kristallisationsversuche. Mehrere Kristallstrukturen konnten im Rahmen dieser Dissertation und in Kollaboration mit Dr. Sander Smits (Universität Düsseldorf) gelöst werden. Hinsichtlich EctD war es möglich Strukturen des Enzyms in seiner Apo-Form, in Komplex mit dem Eisenkofaktor, und in Komplex mit dem Eisenkatalyst, dem Kosubstrat 2-Oxoglutarat und dem Reaktionsprodukt Hydroxyectoin zu lösen. Diese Strukturen lieferten, in Verbindung mit umfassenden ortsgerichteten Mutagenesestudien, einen tiefen Einblick in das katalytische Zentrum von EctD und erlaubten eine Vorhersage für dessen katalysierten Reaktionsmechanismus zu treffen (Vorhersage von Dr. Wolfgang Buckel). Hinsichtlich EctC wurde ein detailliertes Expressions- und Reinigungsprotokoll von EctC aus Sphingopyxis alaskensis in Kollaboration mit Dr. Sander Smits (Universität Düsseldorf) beschrieben, das EctC als Dimer identifiziert und Kristallisationsversuche und vorläufige Röntgenstrukturanalysen-Daten abhandelt, welche eine vielversprechende Grundlage für die Auflösung der EctC Kristallstruktur schaffen, welche aufbauend auf diesen Daten, im Anschluss an die vorliegende Dissertation veröffentlich wurde. Zusammenfassend liefert die vorliegende Dissertation detaillierte Informationen über die phylogenetische Verbreitung und Biochemie der Schlüsselenzyme der Ectoin- und Hydroxyectoin-Biosynthese sowie die gelöste Kristallstruktur von EctD und vielversprechende Kristallisationsverusche von EctC und leistet somit einen substantiellen Beitrag zum Verständnis der Rolle von Ectoinen in der globalen mikrobiellen Osmostress-Anpassung.


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