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Titel: Biochemical and Molecular Investigations of Arabidopsis thaliana Transformed with Genes of Rosmarinic Acid Biosynthesis
Autor: Chahyadi, Agus
Weitere Beteiligte: Petersen, Maike (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2017
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2017/0508
DOI: https://doi.org/10.17192/z2017.0508
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2017-05088
DDC: 570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Biochemische und molekulare Untersuchungen von Arabidopsis thaliana transformiert mit Genen der Rosmarinsäurebiosynthese

Dokument

Schlagwörter:
Arabidopsis thaliana, Rosmarinsäure, Rosmarinsäure Synthase, Hydroxyphenylpyruvat Reduktase, Coleus blumei, Arabidopsis, Pflanzentransformation, Agrobacterium, Rosmarinsäure, Hairy Root, Arabidopsis, Plant transformation, Agrobacterium, rosmarinic acid, hairy root

Summary:
Rosmarinic acid (RA) is an ester of caffeic acid and 3,4-dihydroxyphenyllactic acid (DHPL). This compound is present in various higher plants and some lower plants. However, the occurrence is not consistent since not all members in each level of plant taxa where RA has been shown to be present contain RA. Recent investigations confirm that a number of enzymes involved in the formation of RA are present in all higher plant species and also active in other metabolic pathways. In Arabidopsis thaliana (Brassicaceae), the presence of certain RA biosynthesis genes has been described, but one or more RA specific genes are missing and thus the plant is unable to synthesise RA. Therefore, introducing the cDNA of CbRAS into Arabidopsis might prove the role of enzymes such as HPR2 (a photorespiratory enzyme) and cytochrome P450 monooxygenases from the CYP98A family (enzymes in the formation of monolignols) in providing the substrates and finishing the formation of RA or RA-like esters. The transformed Arabidopsis thaliana was obtained via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation and has been successfully established as cell suspension cultures. The transformed cells were R-lines (plants transformed with the vector containing cDNA of CbRAS) and L-lines (control plants transformed with the empty vector). Molecular characterisation showed that the T-DNA parts, the RAS and CaMV 35S promoter sequences, have been stably integrated in the plant genome. However, the presence of the KanR gene (a non-T-DNA part) in all established cell suspension cultures revealed a phenomenon which is called the integration of the non-T-DNA binary vector backbone sequences. This has been reported in several plant transformation events. The optimum growth of cell suspension cultures including the cell biomass and protein contents was observed in the first week of the cultivation period. Overexpression of the RAS gene slightly reduced the cell growth but did not impair the cells. In addition, strong expression of the RAS gene did not increase the protein content. All the RA biosynthetic enzymes were found to be highly active during the logarithmic growth phase. Enzymes such as TAT, C4H and 4CL reached their maximum activity on day 4, while PAL and RAS on day 6. Overexpression of RAS gene had no influence on the activity of the enzymes in the upstream pathway of RA. Their activities were found to be cell line-specific. The strong expression of the RAS gene did not make all ras-transformed lines having RAS activity. Some of them had exhibited the activity, but later on, the activity was lost. Gene expression analysis did not show any post-transcriptional gene silencing (PTGS) event. Therefore, a complex regulation at the post-translational level might be involved. The transcript level of the RAS gene varied among ras-transformed lines which might be caused by the number and site(s) of T-DNA integration events or cellular responses of the cell lines. The expression pattern of other RA-biosynthetic genes cannot be clearly distinguished between ras-transformed lines, control lines and the wild type. In general, gene transcripts fluctuated and were line-specific. The attempt to overexpress two genes, CbHPPR and CbRAS, in Arabidopsis was achieved by generating hairy roots from ras-transformed lines with the help of Agrobacterium rhizogenes carrying the CbHPPR gene. Only one single hairy root line could be obtained containing both genes. However, the transformed roots exhibited neither RAS activity nor detectable levels of ras transcript; this might be caused by PTGS events. Also, the transformed roots did not show any significant change of the HPPR activity although high expression of the HPPR gene was clearly observed. Accordingly, the attempt to increase the formation of RAS-ester products by double expression of hppr and ras remains unsuccessful. Analysis of metabolite contents by LC-MS showed that ras-transformed cells probably accumulated RA and Caf-pHPL, although the yields were extremely low. Thus, the presence of RAS in Arabidopsis thaliana demonstrates the dual role of HP(P)R in primary and secondary metabolism, by providing glycerate (in photorespiration) and pHPL (for RA biosynthesis), respectively. It also leads us into new perspectives regarding the role of CYP98As in Arabidopsis, the biosynthetic pathway of RA, and the role of vacuoles for RA accumulation. This, however, should be answered in future experiments.

Zusammenfassung:
Rosmarinsäure (RA) ist ein Ester von Kaffeesäure und 3,4-Dihydroxyphenylmilchsäure (DHPL). Dieser Naturstoff kommt in verschiedenen höheren Pflanzen und einigen niedrigeren Pflanzen vor. Allerdings ist das Vorkommen nicht konsistent, da nicht alle Mitglieder in jeder Taxonebene, in der RA gezeigt worden ist, RA enthalten. Neuere Untersuchungen bestätigen, dass einige Enzyme, die an der Bildung von RA beteiligt sind, in allen höheren Pflanzenarten vorhanden und auch in anderen Stoffwechselwegen aktiv sind. In Arabidopsis thaliana (Brassicaceae) wurde die Anwesenheit bestimmter RA-Biosynthese-Gene beschrieben, aber ein oder mehrere RA-spezifische Gene fehlen und somit ist die Pflanze nicht in der Lage, RA zu synthetisieren. Daher könnte das Einbringen der cDNA von CbRAS in Arabidopsis zeigen, ob Enzyme wie HPR2 (ein photorespiratorisches Enzym) und Cytochrom P450 Monooxygenasen aus der CYP98A-Familie (Enzyme bei der Bildung von Monolignolen) an der Bereitstellung der Substrate und der Bildung von RA oder RA-ähnlichen Estern beteiligt sein können. CbRAS-transformierte Arabidopsis thaliana wurden durch Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation gewonnen und erfolgreich als Zellsuspensionskulturen etabliert. Es wurden R-Linien (Pflanzen, die mit dem Vektor transformiert wurden, der cDNA von CbRAS enthielt) und L-Linien (Kontrollpflanzen, die mit dem leeren Vektor transformiert wurden) gewonnen. Die molekulare Charakterisierung zeigte, dass die T-DNA-Teile (RAS- und CaMV-35S-Promotorsequenzen) stabil in das Pflanzengenom integriert wurden. Die Anwesenheit des KanR-Gens (eines Nicht-T-DNA-Teils) in allen etablierten Zellsuspensionskulturen zeigte jedoch ein Phänomen, das auf die Integration der Nicht-T-DNA-Sequenzen des Vektors beruht. Dies wurde schon mehrfach in der Literatur beschrieben. Optimales Wachstum der Zellsuspensionskulturen, bestimmt anhand der Zellbiomasse und des Proteingehalts, wurde in der ersten Woche der Kultivierungsperiode beobachtet. Die Überexpression des RAS-Gens verringerte das Zellwachstum leicht, beeinträchtigte aber die Zellen nicht. Die starke Expression des RAS-Gens erhöhte nicht den Proteingehalt. Alle RA-Biosynthese-Enzyme hatten ihre höchste Aktivität während der logarithmischen Wachstumsphase. Enzyme wie TAT, C4H und 4CL erreichten ihre maximale Aktivität am 4. Tag, PAL und RAS am 6. Tag. Die Überexpression des RAS-Gens hatte keinen Einfluss auf die Aktivität der im RA-Biosyntheseweg vorgeschalteten Enzyme. Ihre Aktivitäten wurden als zelllinienspezifisch eingestuft. Die starke Expression des RAS-Gens führte nicht in allen ras-transformierten Linien zu einer messbaren RAS-Aktivität. Einige Linien hatten anfangs nachweisbare RAS-Aktivität, die jedoch mit zunehmender Passagenanzahl verloren ging. Die Genexpressionsanalyse zeigte, dass posttranskriptionelles Gen Silencing (PTGS) nicht die Ursache hierfür war. Daher könnte eine komplexe Regulation auf der posttranslationalen Ebene beteiligt sein. Die RAS-Transkriptmenge variierte unter den ras-transformierten Linien. Dies könnte durch die Anzahl und die Stelle(n) von T-DNA-Integrationsereignissen oder zellulären Reaktionen der Zelllinien verursacht werden. Das Expressionsmuster anderer an der RA-Biosynthese beteiligter Gene lässt sich nicht klar zwischen ras-transformierten Linien, Kontrolllinien und dem Wildtyp unterscheiden. Im Allgemeinen sind die Transkriptlevel schwankend und linienspezifisch. Der Versuch, zwei Gene, CbHPPR und CbRAS, gleichzeitig in Arabidopsis zu überexprimieren, wurde durch die Erzeugung von „Hairy Root“ aus ras-transformierten Linien mit Hilfe von Agrobacterium rhizogenes erreicht, das das CbHPPR-Gen tragen. Es konnte nur eine einzige „Hairy Root“-Linie erhalten werden, die beide Gene überführte. Die transformierten Wurzeln zeigten jedoch weder RAS-Aktivität noch nachweisbare Mengen an ras-Transkript. Dies könnte durch PTGS-Ereignisse verursacht werden. Außerdem zeigten die transformierten Wurzeln keine signifikante Veränderung der HPPR-Aktivität, obwohl das HPPR-Gen stark exprimiert wurde. Dementsprechend bleibt der Versuch erfolglos, die Bildung von RAS-Esterprodukten durch doppelte Expression von hppr und ras zu erhöhen. Die phenolischen Inhaltsstoffe wurden über LC-MS analysiert. Hierbei zeigte sich, dass ras-transformierte Zellen mit hoher Wahrscheinlichkeit RA und Caf-pHPL akkumulierten, obwohl die Ausbeute extrem niedrig war. Dies ist ein Hinweis darauf, dass bei Anwesenheit von RAS in Arabidopsis thaliana HP(P)R eine doppelte Rolle im Primär- und Sekundärmetabolismus hat, indem sie Glycerat (in der Photorespiration) und pHPL (für die RA-Biosynthese) lieferte. Daraus ergeben sich neue Fragen in Bezug auf die Rolle von CYP98As in Arabidopsis, den Biosyntheseweg der RA und die Rolle der Vakuolen für die RA-Akkumulation. Dies sollte jedoch in zukünftigen Experimenten geklärt werden.


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