Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg

Titel:The species-specific effects of guinea pig adaptive mutations in Marburg virus VP40 and L on the protein’s functions and viral fitness
Autor:Köhler, Alexander
Weitere Beteiligte: Becker, Stephan (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2017
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2017/0337
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2017-03377
DOI: https://doi.org/10.17192/z2017.0337
DDC:570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.):Spezies-spezifische Effekte von adaptiven Mutationen eines Meerschweinchen-letalen Marburg Virus auf die Proteinfunktionen von VP40 und L und die virale Fitness
Publikationsdatum:2017-06-12
Lizenz:https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0

Dokument

Schlagwörter:
Virale Fitness, L, Medizin, Matrix Protein, VP40, virale Polymerase, Marburg Virus, Adaption, Virologie

Summary:
Marburg virus (MARV) is a highly pathogenic virus that causes severe, often lethal diseases specifically in humans and non-human primates. In rodents MARV is non-pathogenic. However, sequential passaging of MARV in rodents results in selection of a rodent-lethal virus. Lofts et al. established a guinea pig-lethal MARV containing only four non-silent amino acid changes in viral genome (Lofts et al., 2007). One amino acid substitution (D184N) was detected in the viral matrix protein VP40 and three amino acid substitutions were detected in the RNA-dependent RNA polymerase L (S741C, D758A and A759D). We analyzed the effects of the guinea pig-adaptive mutations on the functions of VP40 and L in a comparative study including human and guinea pig cells. Functional analyses were performed with ectopically expressed VP40D184N and L mutants by using different assays. The influence of the D184N mutation in VP40 on the replicative capacities of MARV in guinea pig cells was analyzed by infection of cells with recombinant MARV containing the D184N mutation in VP40. The first part of the study demonstrated that a recombinant rMARV containing only the D184N amino acid substitution in VP40 displayed a higher level of viral fitness specifically in guinea pig, but not in human cells. The mutant virus showed higher replicative capacities, enlarged inclusion bodies and enhanced infectivity only in guinea pig cells. Detailed comparative analysis of VP40 functions, in human and guinea pig cells, indicated that the membrane binding capabilities and the interferon antagonistic function were not altered by the D184N amino acid substitution. However, presence of the D184N mutation in VP40 enhanced the production of VP40-induced virus-like particles (VLPs) specifically in guinea pig cells. In addition, the amount of NP in infectious virus-like particles (iVLPs) and virus preparations was enhanced in presence of the D184N mutation in VP40 specifically in guinea pig cells. These data might partially explain the higher infectivity of VP40D184N containing iVLPs compared to wildtype VP40 containing iVLPs. Most importantly, the inhibitory capacity of VP40 on replication and transcription was species-specifically lowered by the D184N mutation in VP40, allowing significantly higher levels of replication and transcription in guinea pig cells. The second part of the study focused on the importance of the mutations in the L protein observed in the guinea pig-lethal MARV. Interestingly, only the S714C substitution increased replication in both species while the other mutations, D758A and A759D severely impaired the polymerase function. All L mutant proteins displayed proper expression and were able to localize into inclusion bodies which represent the sites of viral transcription/replication. Finally, co-expression of plasmids encoding L with the S741C amino acid substitution and VP40D184N in guinea pig cells resulted in eight fold higher levels of replication and transcription in comparison to human cells. This suggested that the D184N mutation in VP40 and the S741C mutation in L together significantly improve replication of MARV in guinea pig cells. Altogether these data suggests that the D184N substitution in VP40 and the S714C substitution in L can contribute to the increased pathogenicity of guinea pig-lethal MARV.

Zusammenfassung:
Das Marburg Virus (MARV) ist hochpathogen und verursacht häufig schwere oft tödlich verlaufende Infektionen in Primaten. In Nagetieren hingegen verursacht das MARV jedoch keine Erkrankung. Sequentielles Passagieren des MARV in Nagetieren führt jedoch zur Selektion von Virusvarianten die eine tödliche Erkrankung in Nagetieren hervorrufen. Lofts et al. konnten durch sequentielles Passagieren ein Meerschweinchen adaptiertes MARV etablieren, das sich vom wildtypischen MARV lediglich durch vier ausgetauschte Aminosäuren unterschied, für die Tiere aber tödlich war (Lofts et al., 2007). Eine, Mutation, D184N, befindet sich in VP40 dem viralen Matrix Protein und drei weitere Mutationen, S741C, D758A, A759D, befinden sich in der viralen RNA-abhängigen RNA Polymerase, dem L Protein. Die molekularen Mechanismen, die durch diese Mutation beeinflusst wurden blieben unklar. Ziel dieser Arbeit war es zu analysieren ob diese adaptiven Mutationen im Meerschweinchen-letalen MARV die Funktionen der Proteine VP40 und L in Meerschweinchenzellen im Vergleich zu menschlichen Zellen beeinflussen. Dazu untersuchten wir durch verschiedene Assays mit Hilfe von ektopischer Überexpression der rekombinanten Proteine VP40 mit der D184N Mutation und für verschiedene L Protein Varianten die jeweiligen Proteinfunktionen. Zusätzlich wurde der Einfluss der D184N Mutation in VP40 auf die replikative Fitness eines rekombinanten MARV bestimmt, welches lediglich die D184N Mutation in VP40 trägt (rMARVVP40(D184N)). Im ersten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt das rMARVVP40(D184N) spezifisch in Meerschweinchenzellen eine gesteigerte Fitness besitzt. Die viralen Transkription/Replikation war verstärkt, es fanden sich vergrößerten viralen Einschlusskörperchen in den infizierten Zellen und die Infektiösität von rMARVVP40(D184N) war spezifisch für Meerschweinchenzellen erhöht. VP40 ist ein multifunktionelles Protein, welches bei der Abwehr der Interferonantwort der Zelle sowie beim Zusammenbau und Abknospen der Viren und bei der Regulation von Transkription/Replikation beteiligt ist. Vergleiche der einzelnen VP40 Funktionen in humanen und Meerschweinchenzellen zeigten, dass die D184N Mutation den VP40-mediierten Interferon Antagonismus sowie die Assoziation von VP40 mit Zellmembranen nicht beeinflussten. Jedoch führte die D184N Mutation in VP40 zu einer Zunahme der Abknospung von VP40-induzierten virus-ähnlichen Partikeln (VLPs) in Meerschweinchenzellen. Zudem führte die D184N Mutation in VP40 zu einer Erhöhung der Menge an Nukleoprotein (NP) in infektiösen virus-ähnlichen Partikeln (iVLPs) lediglich in Meerschweinchenzellen. Diese Daten zeigen, dass viele der Funktionen des VP40 durch die D184N Mutation exklusiv in Meerschweinchenzellen beeinflusst werden und erklären zumindest teilweise die gesteigerte Infektiösität von VP40D184N enthaltenden iVLPs in Meerschweinchenzellen. Der bedeutendste spezies-spezifische Unterschied durch die D184N Mutation in VP40 betraf jedoch die VP40-vermittelten Inhibition der viralen Replikation und Transkription. Diese führte zu einer signifikanten Steigerung der viralen Replikation und Transkription in Meerschweinchenzellen was die Geschwindigkeit des Viruswachstums deutlich beeinflusste. Der zweite Teil dieser Arbeit untersuchte die Bedeutung der deri Mutationen im L Protein des Meerschweinchen-letalen MARV. Interessanterweise führte die S741C Mutation im L Protein zu einer deutlichen, spezies-unabhängigen, Steigerung der viralen Replikation und Transkription. Die Mutationen D758A und A759D hingegen hatten einen massiven Verlust der Polymerase Funktion des L Proteins zur Folge. Abschließend wurde durch Ko-expression der L Variante mit der S741C Mutation und VP40D184N gezeigt dass die Kombination dieser beiden Mutationen zu einer achtfachen Steigerung der viralen Replikation und Transkription in Meerschweinchenzellen gegenüber humanen Zellen führte. Die Daten dieser Arbeit, lassen vermuten, dass die D184N Mutation in VP40 und die S741C Mutation in L zu der hohen Letalität des Meerschweinchen-adaptierten MARV beitragen.


* Das Dokument ist im Internet frei zugänglich - Hinweise zu den Nutzungsrechten