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Titel:Vergleichende qualitative und quantitative Auswertung vo Knochenregeneraten aus beta-Tricalciumphosphaten mittels Histomorphometrie und dreidimensionaler nicht-invasiver Synchrotrontomographie
Autor:Stiller, Felix Siegfried
Weitere Beteiligte: Knabe-Ducheyne, C. (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2017
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2017/0299
DOI: https://doi.org/10.17192/z2017.0299
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2017-02995
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):A comparative quantitative and qualitative analysis of bone tissue regeneration employing beta-tricalcium phosphate by three-dimensional non-invasive synchrotron micro-tomography and histomorphometry
Publikationsdatum:2017-04-27
Lizenz:https://creativecommons.org/licenses/by/4.0

Dokument

Schlagwörter:
Knochenregenerate, bone, Tricalciumphosphate, Histomorphologie, Knochenersatz, Kieferhöhle, Synchrotron, Knochen, histomorphometry, Dimension 3, synchrotron

Zusammenfassung:
Das Ziel der Studie war die vergleichende Untersuchung der Knochenneubildung nach Sinusbodenelevation mittels konventioneller Histomorphometrie und Synchrotron-Tomographie. Standardverfahren zur Beurteilung derartiger Prozesse sind die histomorphometrische oder immunhistologische Analyse von Schnitten, oder als dreidimensionales röntgenologisches Verfahren, das Mikro-Computertomogramm. In der vorliegenden Studie wurde Synchrotronstrahlung zur Auswertung der Proben verwendet, die eine deutlich höhere Strahlenintensität bzw. Photonendichte und damit verbunden höhere Auflösung, als ein Mikro-CT besitzt. Vergleichend wurden dazu histologische Schnittbilder herangezogen, um die jeweiligen verfahrenstechnischen Unterschiede aufzuzeigen und diese hinsichtlich der diagnostischen Relevanz zu bewerten. Um Implantationen in immer schwierigeren anatomischen Situationen vornehmen zu können, wurde verschiedene Vorgehensweisen zur Schaffung eines sicheren und funktionsstabilen Knochenlagers entwickelt. Die Verwendung von β-Trikalziumphosphaten wurde in zahlreichen Studien hinlänglich untersucht und beschrieben. Eine Untersuchung mittels Synchrotronstrahlung an einer größeren Probenzahl wurde bislang in der Literatur nicht beschrieben. Diese ermöglicht eine völlig neue Dimension der dreidimensionalen Darstellung des Knochens und des KEM. Synchrot-ronstrahlung wird in einem Teilchenbeschleuniger erzeugt. Aufgrund der Größe der technischen Anlage können um ein vielfaches höhere Photonenflussdichten als beim konventionellen Röntgen erreicht werden, die ein Hauptkriterium für die Qualität der tomographischen Bilder darstellen. Außerdem wird durch den Abstand von bis zu 140 m (im ESRF in Grenoble) zwischen Untersuchungsobjekt und Strahlungsquelle ein nahezu paralleler Strahlenverlauf ermöglicht, was eine, im Vergleich zum Mikro-CT, verzerrungsfreie Wiedergabe ermöglicht. Die Proben wurden zunächst mittels Synchrotron-Tomograph (Sy-CT) untersucht und danach in Schnitte zersägt. Die der Histologie äquivalente Ebene wurde in dem dreidimensionalen Datensatz aufwendig manuell bestimmt, um einen direkten Vergleich zwischen den beiden Verfahren zu ermöglichen. Die Bioptate wurden je nach Intaktheit der Knochensäule, Qualität der tomographischen Untersuchung und Übereinstimmung der zwei äquivalenten Ebenen in drei Klassen eingeteilt. Die erste Klasse enthält die besten Proben, die eine komplette Integrität und eine sehr gute Übereinstimmung der äquivalenten Ebenen aufweisen. Die Proben der zweiten Klasse weisen einige Mängel auf, z.B. eine leicht deformierte Knochensäule oder einige Unterschiede der äquivalenten Ebenen. Die Proben der dritten Klasse weisen erheblichere Mängel auf, die äquivalenten Ebenen sind aber in wesentlichen Details zuzuordnen. Die Sy-CT Bilder, die alle Details des Untersuchungsobjektes abhängig von der Dichte in Grauabstufungen wiedergeben, müssen zur Erfassung der Knochenmasse in Bool´sche Bilder (reine Schwarz-Weiß-Bilder) umgewandelt werden. Ein Knochenfenster im Histogramm legt fest, welche der Grauwerte als Knochen zu identifizieren sind und stellt diese anschließend weiß dar. Alle anderen Dichtewerte werden schwarz dargestellt. In diesen Datensätzen lässt sich durch Summation der weißen Pixel die Knochenmenge bestimmen. Für jede Probe wurde dreimal die gebildete Knochenmenge bestimmt. Zum ersten in der Histologie durch manuelles Vermessen und zum zweiten in der äquivalenten Ebene des dreidimensionales Datensatzes. Zum dritten wurde die Knochenmenge über die gesamte Biopsiesäule bestimmt, um diese besondere Möglichkeit des Sy-CT für die Einschätzung der klinschen Wertigkeit des ß-TCP auszunutzen. Der 2D-Wert spiegelt das Ausmaß der Knochenneubildung in der zufällig gewählten histologischen Ebene im Sy-CT-Datensatz wider und der 3D-Wert gibt die real gebildete Knochenmenge im gesamten Biopsiezylinder wieder. Die Differenz dieser zeigt an, wie groß der mögliche Fehler in der Angabe der Menge der Knochenneubildung für einen räumlichen Bereich ist, wenn nur ein histologischer Schnitt als Grundlage verwendet wird. Der Mittelwert der Abweichung beträgt über alle Proben ±4,48%. Die Abweichungen betrugen jedoch bis zu 18%. In der vorliegenden Studie bestand für die jeweilige Schnittebene eine hohe Übereinstimmung zwischen dem konventionellen histologischen Schnittbild und dem korrespondierenden Synchrotron-Bild. Bei der Synchrotonuntersuchung bleiben die Proben intakt und können gegebenenfalls ein weiteres mal oder durch an¬dere Verfahren untersucht werden, wie in dieser Studie geschehen. Inhaltlich bietet die Sy-CT ebenfalls neue Möglichkeiten. Dargestellt werden nun-mehr nicht nur einzelne Schichten einer Probe, sondern eine gesamte Knochen-probe mit ihrer komplexen Struktur, in einer Qualität, die bisher kein anderes Untersuchungsverfahren erreicht hat. Die Entwicklung des Knochens lässt sich durch die Mineralisierungsgrade, die sich aus den Grau-Werten der Bilder ablesen lassen, noch weiter beurteilen. So ist zu erkennen, zu welchem Zeitpunkt einzelne Bereiche in der Entwicklung des Knochens mineralisiert wurden. Auf zellulärer Ebene sind der Synchrotron-Tomographie noch Grenzen gesetzt. Die Immunhistologie hat in diesem Bereich klare Vorteile. Hier ist es möglich, mittels verschiedener Antikörper-Färbungen einzelne Zelltypen hervorzuheben und deren Aktivität in unterschiedlichen Knochenbildungsphasen zu beurteilen. Die Auflösung des Sy-CT wird stetig durch bessere Optiken und höhere Photonenflussraten verbessert, sodass mittlerweile auch zelluläre Strukturen dargestellt werden können, doch deren Qualität der Darstellung liegt noch unter der Qualität der Histologie. Bei allen Verbesserungen der Strahlenuntersuchungen sollte man nicht ignorieren, dass biologische Materialien nicht jede Dosis vertragen und es dadurch zu Veränderungen kommen kann. In der vorliegenden Studie konnten wir zeigen, dass auch die Untersuchung von Proben geringerer Qualität (Klasse 3) mit Synchrotronstrahlung valide Ergebnisse ermöglicht und Knochenneubildungsraten, wenn auch approximierend, ermittelt werden können. Diese Proben sind mittels Histologie schwieriger oder gar nicht auszuwerten, da die Proben zum Beispiel aufgrund der mechanischen Verformung kleinere und unregelmäßigere Untersuchungsfelder besitzen und damit schwer zu vermessen sind. Die verwendeten β-TCP haben sich auch in der vorliegenden Studie als im oralchirurgischen Bereich gut verwendbare KEM erwiesen. In allen Proben zeigten sich auch im Sy-CT ausgeprägte Formationen von neugebildetem Geflechtknochen. Zusammenfassend gelang durch die vorliegende synchrotrontomographische Studie erstmalig der Nachweis, dass konventionelle histomorphometrische Unter-suchungsverfahren für kleine homogene Bioptate als Standard ausreichend gute Ergebnisse liefern, für kleine anisotrope Bioptate eine dreidimensionale Analyse mittels Sy-CT jedoch eine wesentlich exaktere Darstellung der Knochenstruktur ermöglicht wird.

Summary:
The aim of this study was to evaluate the validity of two dimensional histo-morphometric measurement of bone biopsy specimen after sinus floor evaluation by means of high contrast, high resolution, three-dimensional and non-destructive synchrotron micro-tomography (SCT). Histomorphometry and immune-histology or three-dimensional x-ray method micro computer tomography is still the gold standard for evaluating bone specimen. In this study evaluation was done by high contrast, high resolution, three-dimensional and non-destructive synchrotron micro-tomography (SCT) and compared to standard histology in order to demonstrate the potential of this new approach for the evaluation of bone biopsy samples. First, the bone biopsy specimen were analysed in SCT and then cut into slices from histologic sections. The histologic sections were searched manually in the three-dimensional data of SCT to have a direct comparison between these different procedures. The bone samples were classified into groups from one to three depending on the integerity of their bone pillar, the quality of tomography analysis and the analogy between the two-dimensional SCT section and the histology. The first group contained samples of best quality bone specimen and the third group samples of lowest quality specimen. The SCT images picture all details of the samples on a grey scale, depending of their mass density. In order to calculate the bone mass, SCT images needed to be converted into black-and-white boolean data sets. All grey-scales expected to be bone were pictured white and all those that were expected not to be bone, such as unmineralized osteoid or blood, were pictured black. The bone mass was determined by adding of all white pixel. For every sample the bone mass was calculated three times. First, the histologic section was measured manually, second the equivalent section of three-dimensional SCT data set. Third, the bone mass was measured on the whole three-dimensional (3D) pillar which is the new opportunity of SCT analysation. The 2D data represent the bone mass in a randomly chosen histologic section in contrast to the 3D data which represent the real bone mass of the whole bone pillar. The deviation between these two results shows the possible error of measurement while using 2D analysis instead of 3D for complex situations. In total the deviation is ±4,48% but up to 18%. The SCT data reveals new quality of bone images. Not just two or three sections of a sample can be analysed, but the whole specimen with all kinds of complex structures. The development of the bone can be read off the mineralisation lines which are represented by different grey scales in the bone. On cellular level there are still set boundaries for SCT. Immune-histology has the advantage of different antibody staining methods to distinguish between cell types and their activity. But due to better optics and higher photon flux the resolution of SCT is getting higher, meaning that it is already possible to picture cellulare structures. In this reagard one should not forget that biological materials can be altered by too high a dose of photon flux. This study showed that even samples of lower quality bone specimen (group 3) can be analysed by SCT giving valid results for bone mass. Samples of lower quality are hard to evaluate by histologic sectioning because of mechanical instability and smaller areas to measure. The beta-tricalcium phosphate used in all samples showed distinct formations of newly built woven bone. An application in oral surgery can be recommended. To summarise, histological analysation can remain standard for big homogeneous samples but for smaller and heterogeneous samples three-dimensional analysation with SCT is more accurate and offers a better representation of bone structures.


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