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Titel:Einfluss des Wachstums-Differenzierungs-Faktors-15 (GDF-15) auf die Gen- und Proteinexpression des Musculus gastrocnemius bei hypercholesterinämischen (knockout) Mäusen.
Autor:Wagner, Moritz
Weitere Beteiligte: Kinscherf, Ralf (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2017
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2017/0149
DOI: https://doi.org/10.17192/z2017.0149
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2017-01491
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):Influence of Growth differentiation factor-15 (GDF-15) on the gene and protein expression in gastrocnemius muscle of hypercholesterolemic (knockout) mice.
Publikationsdatum:2017-03-01
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
ApoE, Arteriosklerose, Growth differentiation factor, muscle, GDF-15, Muskel, ApoE, atherosclerosis, Wachstums-Differenzierungs-Faktor, GDF-15

Zusammenfassung:
Einleitung: Der Wachstums-Differenzierungs-Faktor-15 (GDF-15) gehört zur TGF-β-Superfamilie und wird bei Entzündungen und Stressexposition insbesondere von Makrophagen, Gefäßmuskelzellen, Kardiomyozyten, Adipozyten und Endothelzellen vermehrt exprimiert (Schlittenhardt et al., 2004; Bauskin et al., 2005; Bermúdez et al., 2008; Ding et al., 2009; Adela and Banerjee, 2015). In früheren Arbeiten haben wir gezeigt, dass die Protein- und mRNA-Expression von GDF-15 in arteriosklerotischen Gefäßwänden induziert und dort in Makrophagen lokalisiert ist (Schlittenhardt et al., 2004; Bonaterra et al., 2012). GDF-15 dient als neuer Biomarker für kardiovaskulären Stress und ist u.a. mit Herzinsuffizienz und kardialem Remodeling assoziiert (Andersson et al., 2016; Meijers et al., 2016). Außerdem wurde gefunden, dass bei GDF-15-Defizienz die Entstehung und Progression der Arteriosklerose gehemmt ist (de Jager et al., 2011; Bonaterra et al., 2012). In der vorliegenden Studie sollte der Einfluss von GDF-15 auf die Expression inflammatorischer, angiogenetischer, apoptotischer bzw. atrophischer Gene/Proteine in der Skelettmuskulatur bei cholesteringefütterten Mäusen in einem Mausmodell für experimentelle Arteriosklerose (ApoE-/-) untersucht werden. Material und Methoden: Mithilfe eines LacZknockin-Konstrukts wurden GDF-15-defiziente Mäuse generiert (Strelau et al., 2009) und anschließend mit ApoE-/--Mäusen gekreuzt, sodass folgende Genotypen zur Verfügung standen: GDF-15+/+/ApoE+/+ (Wildtyp), GDF-15-/-/ApoE+/+, GDF-15+/+/ApoE-/- und GDF-15-/-/ApoE-/-. Im Alter von zehn Wochen wurden die Tiere mit einem cholesterinreichen Futter (CHF) über einen Zeitraum von 12 bzw. 20 Wochen gefüttert. Das Gewicht sowie die Serum-Cholesterin- und -Triglyzeridspiegel der Mäuse wurden dabei vor CHF-Gabe und nach 12 bzw. 20 Wochen cholesterinreicher Fütterung bestimmt. Anschließend wurde der M. gastrocnemius entnommen und RNA sowie Proteine isoliert. Die mRNA-Expression von relevanten Genen für Inflammation, Apoptose, Angiogenese, Atrophie und nikotinerge Acetylcholin-Rezeptoren (AChR) wurde mithilfe quantitativer Real-Time RT-PCR (qRT-PCR) untersucht. Auf Proteinebene wurden im Skelettmuskel u.a. pro-/anti-inflammatorische Zytokine und pro-/anti-angiogenetische Chemokine mittels „Proteome Profiler™ Mouse Cytokine Array Kit“-System quantifiziert. Ergebnisse: Das Gewicht war bei GDF-15-/-/ApoE+/+-Mäusen nach 20 Wochen CHF (10 %; p≤0,01) und bei GDF-15-/-/ApoE-/--Tieren vor CHF (6 %; p≤0,01) und nach 12 (16 %; p≤0,01) bzw. 20 Wochen CHF (34 %; p≤0,001) höher als bei Wildtyp- bzw. GDF-15+/+/ApoE-/--Mäusen (Kubo, 2013). Der Serum-Cholesterinspiegel war bei GDF-15-/-/ApoE-/--Mäusen vor CHF (22 %; p≤0,05) und nach 12 (34 %; p≤0,001) bzw. 20 Wochen CHF (14 %; p≤0,05) höher als bei GDF-15+/+/ApoE-/--Mäusen (Kubo, 2013). Des Weiteren waren bei GDF-15-/-/ApoE+/+-Mäusen nach 12 (54 %; p≤0,05) bzw. 20 Wochen CHF (35 %; p≤0,05) und bei GDF-15-/-/ApoE-/--Mäusen nach 20 Wochen CHF (95 %; p≤0,01) die Serum-Triglyzeridspiegel höher als bei Wildtyp- bzw. GDF-15+/+/ApoE-/--Mäusen (Kubo, 2013). Nach 12 Wochen CHF zeigte die quantitative Real-Time RT-PCR im M. gastrocnemius von GDF-15-/-/ApoE+/+-Mäusen eine 21- und 6fach (p≤0,05) höhere IL-6- bzw. IL-1β-Expression im Vergleich zu Wildtyp-Tieren. Nach 20 Wochen CHF konnte eine 69 % bzw. 98 % (p≤0,05) niedrigere IL-6- bzw. IL-1β-mRNA-Expression in dieser Gruppe festgestellt werden. Die Expression des pro-apoptotischen Bax-Gens war im M. gastrocnemius von GDF-15-/-/ApoE+/+-Mäusen nach 12 Wochen CHF 31fach (p≤0,05) höher als bei Wildtyp-Tieren. Darüber hinaus fanden wir nach 20 Wochen CHF in GDF-15-/-/ApoE-/--Mäusen eine 86 % (p≤0,05) niedrigere Bax-Expression als bei GDF-15+/+/ApoE-/--Tieren. Die Expression des pro-angiogenetischen Notch1-Gens war nach 20 Wochen CHF im M. gastrocnemius von GDF-15-/-/ApoE-/--Mäusen 97 % (p≤0,05) niedriger als bei GDF-15+/+/ApoE-/--Tieren. Die mRNA-Expression des Fbxo32-Atrophie-Gens war nach 12 Wochen CHF in GDF-15-/-/ApoE+/+-Mäusen 23fach höher (p≤0,05) als bei Wildtyp-Tieren. Darüber hinaus zeigte die Untersuchung mittels membranbasiertem Sandwich-Immunassay (Proteome Profiler™ Mouse Cytokine Array Kit) im M. gastrocnemius von GDF-15-/-/ApoE+/+-Mäusen nach 20 Wochen CHF eine 1,5-3,1fach erhöhte Proteinexpression pro-inflammatorischer (z.B. IL-1β, IL-6, IL-17, IFN-γ und TNF-α) und eine 1,2-2,5fach erhöhte Proteinexpression anti-inflammatorischer (z.B. IL-4, IL-10 und IL-13) Zytokine im Vergleich zu Wildtyp-Tieren. Im M. gastrocnemius von GDF-15-/-/ApoE-/--Mäusen war nach 20 Wochen CHF die Expression sowohl pro- als auch anti-inflammatorischer Proteine 39-85 % im Vergleich zu GDF-15+/+/ApoE-/--Tieren erniedrigt. Die Proteinexpression inflammatorischer und pro-/anti- angiogenetischer Chemokine (z.B. CCL2, CXCL1 und CXCL9) war im M. gastrocnemius von GDF-15-/-/ApoE+/+-Mäusen verglichen mit Wildtyp-Tieren nach 20 Wochen CHF 1,1-2,7fach erhöht. GDF-15-/-/ApoE-/--Mäuse hatten nach 20 Wochen CHF im M. gastrocnemius im Vergleich zu GDF-15+/+/ApoE-/--Tieren eine 45-73 % niedrigere Proteinexpression inflammatorischer und angiogenetischer Chemokine. Schlussfolgerung: GDF-15 scheint im M. gastrocnemius die Expression pro-/anti-inflammatorischer, pro-/anti-angiogenetischer, apoptose- und atrophierelevanter Gene/Proteine abhängig von der Fütterungsdauer zu beeinflussen. Des Weiteren moduliert GDF-15 das Gewicht sowie die Serum-Cholesterin- bzw. -Triglyzeridspiegel.

Summary:
Introduction: Growth differentiation factor-15 (GDF-15) is a distant member of the TGF-β superfamily and is induced under inflammatory and stress conditions particularly in macrophages, smooth muscle cells, cardiomyocytes, adipocytes and endothelial cells (Schlittenhardt et al., 2004; Bauskin et al., 2005; Bermúdez et al., 2008; Ding et al., 2009; Adela and Banerjee, 2015). In former studies we showed an induction of GDF-15 protein and mRNA expression in human arteriosclerotic vessel walls and a localisation in macrophages (Schlittenhardt et al., 2004; Schlittenhardt et al., 2005). GDF-15 is a new biomarker for cardiovascular stress and is associated with heart failure and cardiac remodeling (Andersson et al., 2016; Meijers et al., 2016). Recently, we have shown that GDF-15 deficiency inhibits atherosclerosis development and progression (de Jager et al., 2011; Bonaterra et al., 2012). The aim of the present study was to investigate the influence of GDF-15 on the expression of inflammatory, angiogenic, apoptotic and atrophy genes/proteins in the skeletal muscle of mice fed a cholesterol-enriched diet in a mouse model for experimental atherosclerosis (ApoE-/-). Methods: GDF-15 deficient (GDF-15-/-) mice were generated using a LacZknockin construct (Strelau et al., 2009). These GDF-15-/- mice were cross-bred with ApoE-/- mice, yielding the following genotypes: GDF-15+/+/ApoE+/+ (wild type; WT), GDF-15-/-/ApoE+/+, GDF-15+/+/ApoE-/- and GDF-15-/-/ApoE-/-. 10 weeks old mice received a cholesterol-enriched diet (CED) for 12 or 20 weeks. The weight and the blood lipid concentrations of the animals were measured before CED and after feeding a cholesterol-enriched diet for 12 or 20 weeks. Afterwards the gastrocnemius muscles were dissected and shock-frozen. RNA and proteins were isolated, relevant genes for inflammation, apoptosis, angiogenesis, atrophy and nicotinic acetylcholine receptor (AChR) were analysed by quantitative Real-Time RT-PCR (qRT-PCR). Proteins in skeletal muscle were quantified for pro-/anti-inflammatory cytokines and pro-/anti-angiogenic chemokines using a “Proteome Profiler™ Mouse Cytokine Array Kit” system. Results: The weight was increased in GDF-15-/-/ApoE+/+ mice after 20 weeks CED (10 %; p≤0.01) and in GDF-15-/-/ApoE-/- mice before CED (6 %; p≤0.01) and after 12 (16 %; p≤0.01) or 20 weeks CED (34 %; p≤0.001) compared with WT or GDF-15+/+/ApoE-/- mice (Kubo, 2013). The serum cholesterol level was increased in GDF-15-/-/ApoE-/- mice before CED (22 %; p≤0.05) and after 12 (34 %; p≤0,001) or 20 weeks CED (14 %; p≤0,05) compared with GDF-15+/+/ApoE-/- animals (Kubo, 2013). Further, the serum triglyceride level was increased in GDF-15-/-/ApoE+/+ mice after 12 (54 %; p≤0.05) or 20 weeks CED (35 %; p≤0.05) and in GDF-15-/-/ApoE-/- mice after 20 weeks CED (95 %; p≤0.01) in comparison with WT or GDF-15+/+/ApoE-/- mice (Kubo, 2013). After 12 weeks CED, qRT-PCR showed in gastrocnemius muscle of GDF-15-/-/ApoE+/+ mice a 21- and 6-fold (p≤0.05) IL-6 and IL-1β expression compared with WT. After 20 weeks CED, a 69 % and 98 % (p≤0.05) decrease of IL-6 and IL-1β expression in this group was measured. Pro-apoptotic Bax mRNA expression was 31-fold increased (p≤0.05) in gastrocnemius muscle of GDF-15-/-/ApoE+/+ mice after 12 weeks CED compared with WT. Moreover, we found in gastrocnemius muscle of GDF-15-/-/ApoE-/- mice a 86 % (p≤0.05) decrease of Bax expression compared with GDF-15+/+/ApoE-/- mice after 20 weeks CED. Expression of pro-angiogenic Notch1 gene was 97 % decreased (p≤0.05) in gastrocnemius muscle of GDF-15-/-/ApoE-/- compared with GDF-15+/+/ApoE-/- mice after 20 weeks CED. Expression of atrophy gene Fbxo32 was 23-fold increased (p≤0.05) in GDF-15-/-/ApoE+/+ mice after 12 weeks CED compared with WT mice. Furthermore, the analysis with membrane-based sandwich immunoassay (Proteome Profiler™ Mouse Cytokine Array Kit) showed in gastrocnemius muscle of GDF-15-/-/ApoE+/+ mice after 20 weeks CED a 1.5-3.1-fold increased protein expression of pro-inflammatory (e.g. IL-1β, IL-6, IL-17, IFN-γ and TNF-α) and a 1.2-2.5-fold increased protein expression of anti-inflammatory (e.g. IL-4, IL-10 and IL-13) cytokines compared with WT mice. In gastrocnemius muscle of GDF-15-/-/ApoE-/- mice after 20 weeks CED, a 39-85 % decrease of pro- and anti-inflammatory protein expression was measured compared with GDF-15+/+/ApoE-/- mice. The protein expression of inflammatory and pro-/anti-angiogenic chemokines (e.g. CCL2, CXCL1 and CXCL9) in gastrocnemius muscle of GDF-15-/-/ApoE+/+ mice after 20 weeks was 1.1-2.7-fold increased compared with WT mice. Protein expression of inflammatory and angiogenic chemokines in gastrocnemius muscle of GDF-15-/-/ApoE-/- mice after 20 weeks CED was 45-73 % decreased compared with GDF-15+/+/ApoE-/- mice. Conclusion: The lack of GDF-15 seems to modulate the expression of pro-/anti-inflammatory, pro-/anti-angiogenic, apoptotic and atrophy genes/proteins in gastrocnemius muscle dependent from the duration of CED application. Furthermore, GDF-15 influences the weight and the blood lipid concentrations.


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