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Titel:Etablierung des stickstofffixierenden Alphaproteobakteriums Sinorhizobium meliloti als Chassis-Organismus in der Synthetischen Mikrobiologie
Autor:Döhlemann, Johannes
Weitere Beteiligte: Becker, Anke (Prof, Dr)
Veröffentlicht:2016
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2017/0142
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2017-01426
DOI: https://doi.org/10.17192/z2017.0142
DDC:570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.):Establishment of the nitrogen-fixing alphaproteobacterium Sinorhizobium meliloti as chassis for synthetic microbiology
Publikationsdatum:2017-02-23
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Biotechnology, Synthetische Biologie, Biotechnologie, Synthetic Biology, Genetics, Genetik

Zusammenfassung:
Die Synthetische Biologie benötigt Strategien, die effizientes Genetic Engineering erlauben. Eine grundlegende Voraussetzung hierzu ist die Etablierung von Techniken zur spezifischen DNA-Modifikation im Umfang einzelner Nukleotide bis hin zu ganzen Chromosomen. Während für Modellorganismen der Synthetischen Mikrobiologie ein großes Repertoire leistungsfähiger Werkzeuge zur Verfügung steht, war das Methodenspektrum zur genetischen Veränderung von Rhizobien aus der Klasse der Alphaproteobakterien lange Zeit eingeschränkt. In symbiotischen Lebensgemeinschaften mit Leguminosen besitzt Sinorhizobium meliloti die Fähigkeit, atmosphärischen Stickstoff zu biogenen Stickstoffverbindungen zu assimilieren, wodurch dem α-Rhizobium insbesondere landwirtschaftliche Relevanz zukommt. Aufgrund seiner besonderen Genomarchitektur, die neben einem Chromosom ein weiteres Chromid (pSymB) und Megaplasmid (pSymA) aufweist, ist S. meliloti außerdem ein Modellorganismus zur Erforschung mehrteiliger Genome in Bakterien. pSymA und pSymB, die ~45% der genomischen DNA tragen, besitzen repABC-basierte Replikationsursprünge, welche die Integration dieser extra-chromosomalen Replikons in den Zellzyklus vermitteln. Die repABC-Region wurde in dieser Arbeit als funktionelle Einheit identifiziert, die Chromosomen-ähnliche Eigenschaften wie eine stabile Vererbung und einfache Kopienzahl vermittelt. Auf Basis heterologer repABC-Kassetten verschiedener α-Rhizobien konnte außerdem ein Shuttle-Vektorsystem etabliert werden. Ein modulares und standardisiertes Assemblierungssystem ermöglichte hierbei die in-vitro Herstellung artifizieller Mini-Replikons. Diese können sowohl als klassische Klonierungsvektoren in E. coli, aber auch zur Etablierung mehrteiliger Expressionssysteme in S. meliloti eingesetzt werden. Eine neue Genome Editing-Methode sowie verbesserte Cre/lox-basierte Rekombinationsstrategien wurden entwickelt und erweitern das Repertoire genetischer Werkzeuge für S. meliloti. Ihre Anwendung konnte mittels Deletion und Inversion umfangreicher Genomabschnitte, sowie substantieller Genom-Umstrukturierungen demonstriert werden. Cre/lox-Anwendungen und eine Methode zur in-vivo Klonierung großer DNA-Fragmente ermöglichen neue experimentelle Ansätze, die bei der mechanistischen Aufklärung des mehrteiligen Genoms sowie in synthetischen Anwendungen von großem Nutzen sind. Die robuste Funktion des Cre/lox-Systems und die weite Verbreitung repABC-basierter Replikons innerhalb der α-Rhizobien bergen zudem das Potential, die in dieser Arbeit etablierten Methoden auf weitere Vertreter dieser landwirschaftlich und biotechnologisch relevanten Organismen zu übertragen.

Summary:
Synthetic biology requires strategies, which facilitate efficient genetic engineering. DNA editing in the range of single nucleotides up to whole genomes requires appropriate molecular methods. While powerful tools are available for prokaryotic model organisms, the repertoire for genetic engineering of rhizobia of the class alphaproteobacteria is still limited. The α-rhizobium Sinorhizobium meliloti is able to fix atmospheric nitrogen in symbiotic relationships with legumes. Therefore it is of high agricultural value. Due to its remarkable genome architecture, which besides a main chromosome exhibits a chromid (pSymB) and a megaplasmid (pSymA), S. meliloti emerged as model organism for studying multipartite genomes in bacteria. pSymA and pSymB carry ~45% of the genomic content and are based on repABC-type replication origins, which integrate these extra-chromosomal replicons into the cell cycle. The repABC region of pSymA was further identified to confer the chromosome-like features as single copy replication and stable inheritance to artificial DNA constructs. In this work, heterologous repABC cassettes derived from different rhizobial species were used to establish a novel shuttle-vector system for S. meliloti. This highly modular and standardized assembly system facilitates in-vitro construction of artificial mini replicons. Resulting pABC vectors serve as E. coli-compatible cloning vehicels and enable establishment of complex, single-copy expression systems. Furthermore, a cloning-free genome editing method and an optimized Cre/lox recombination system were developed and expand the genetic toolbox of S. meliloti. Respective engineering approaches were demonstrated by substantial genome rearrangements and large scale deletion and inversion systems. Cre/lox recombination strategies and an inducible repABC-type replication origin further facilitated in-vivo cloning, which enables new experimental approaches both in genome biology, as well as for synthetic applications. The robust function of Cre/lox and the wide distribution of repABC-based replicons among the alphaproteobacteria likely allow an application of the established methods in additional organisms to exploit their genetic resources for agricultural and biotechnological purposes.

Bibliographie / References

  1. 3.2.2 repABC-Engineering hat biologisches und synthetisches Anwendungspotential 4. Fazit
  2. 2. Döhlemann, J; Brennecke, M; Becker; A (2016). Cloning-free genome engineering in 1. Zusammenfassung
  3. 6.3 Cloning-free genome engineering in Sinorhizobium meliloti advances applications of Cre/loxP site-specific recombination
  4. 3.1.1 Etablierung von Sinorhizobium meliloti Rm1021 als Engineering-Plattform 3.1.2 Cre/lox-Rekombinationssysteme ermöglichen substantielle Genom-Umstrukturierungen 3.2 Entwicklung neuer Genetic Engineering-Ansätze mit hohem Anwendungspotential in biotechnologischen und biologischen Fragestellungen
  5. 2.1.1 Genetische Werkzeuge zur in-vivo Modifikation einzelner Gene und bakterieller Genome 2.1.1.1 Methoden des ortsspezifischen Genome Editings
  6. 6.1 Konstruktion der S. meliloti Fusionsstämme SmAB und SmABC 6.2 Spatiotemporal choreography of chromosome and megaplasmids in the Sinorhizobium meliloti cell cycle
  7. 3.2.1.3 Die Cre/lox-vermittelte Relokalisation eines DNA-Fragments ermöglicht die in-vivo Klonierung großer Gen-Cluster
  8. 3.1 Optimierung und Entwicklung neuer Genome Editing- und Engineering-Verfahren für Sinorhizobium meliloti
  9. 2.1.1.2 Rekombinasen ermöglichen umfangreiche in-vivo DNA-Modifikationen 2.1.2 Genome Engineering in der Synthetischen Mikrobiologie 2.2 Sinorhizobium meliloti ist ein Stickstoff-Fixierer mit landwirtschaftlicher Bedeutung 2.2.1 Alphaproteobakterien besitzen mehrteilige Genome mit repABC-basierten Replikationsursprüngen
  10. 2.2.2 Sinorhizobium meliloti als Modellorganismus der Synthetischen Mikrobiologie 2.3 Ziele der Arbeit
  11. 3.2.1.1 pABC Shuttle-Vektoren sind artifizielle Mini-Replikons mit modularem Aufbau 3.2.1.2 Ein konserviertes Motiv im repABC-Operon


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