Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg

Titel:Rekombinante Produktion, Aufreinigung und Kristallisation der Shigella PathogenitätsfaktorenSpa15, IpgC und OspD1
Autor:Jüngel, Jessica
Weitere Beteiligte: Reuter, Klaus (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2016
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2017/0070
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2017-00709
DOI: https://doi.org/10.17192/z2017.0070
DDC:500 Naturwissenschaften
Titel(trans.):Recombinant production, purification and crystallization of the Shigellapathogenic factors Spa15, IpgC and OspD1
Publikationsdatum:2017-02-28
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Biochemie, protein crystallography, shigella, structure biochemistry, Proteinkristallographie, Strukturbiochemie, pathogenic factors, Molekularbiologie, Pathogenität, Kristallisation, Proteine, Shigella, Aufreinigung, Pathogenitätsfaktoren, Struktur

Zusammenfassung:
Viele gramnegative Bakterien, so auch Shigella flexneri, benutzen einen Typ-III Sekretionsapparat (T3SA), welcher der Sekretion bakterieller Proteine in eukaryotische Zellen dient. Diese Proteine ermöglichen es den Bakterien, die eukaryotischen Zellen zu infizieren. Etwa 20 strukturelle Proteine sowie Chaperone aus dem mxi-spa-Operon sind nötig, um den T3SA zu bilden. Die sogenannten „frühen Gene“ des Shigella-Virulenzplasmids erhalten Informationen für die Synthese der strukturellen Proteine und Invasine. Sie werden von VirF reguliert. Die „später abgelesenen Gene“ des Plasmids stellen sicher, dass die Wirtszelle möglichst lange am Leben bleibt und werden vom Transkriptionsaktivator MxiE reguliert. Ihre Regulation auf Transkriptionsebene erfolgt durch die Aktivierung des Typ-III Translokons. In dieser Arbeit steht der Pathogenitätsfaktor OspD1 im Vordergrund, dessen Wechselwirkung mit dem Chaperon Spa15 sowie mit dem Transkriptionsregulator MxiE biochemisch und kristallographisch untersucht wurde. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein verbessertes Expressionssystem für OspD1 mit einem MaltoseBindeprotein-Fusionsanteil etabliert, um das Protein rein darzustellen. Kristallisationsversuche zeigten Bedingungen, unter denen es möglich war, OspD1- Kristalle bei 4 °C wachsen zu lassen. Nach einigen Verbesserungen konnte ein nativer Datensatz mit einer Auflösung von 2,34 Å gesammelt werden. Jedoch war es trotz intensiver Bemühungen im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich die Struktur aufzuklären. Versuche, den gesammelten Datensatz mittels Molecular Replacement zu lösen, waren aufgrund des Fehlens eines geeigneten Strukturmodells mit ausreichend Homologie nicht erfolgreich. Bei zahlreichen darauffolgenden Versuchen, die Struktur mit Hilfe von Schwermetallderivaten aufzuklären, konnten Datensätze gesammelt werden, welche allerdings nicht auswertbar waren. Ein Selenomethioninderivat, welches die Strukturaufklärung mittels eines MADExperiments ermöglichen sollte, wurde erfolgreich exprimiert, konnte aber final aufgereinigt werden. Um die Wechselwirkung von Spa15 mit OspD1 dennoch kristallographisch zu charakterisieren, wurden zum einen Kristallisationsversuche des Komplexes unternommen und zum anderen Peptide unterschiedlicher Länge von OspD1 synthetisiert, deren Sequenz in dem Bereich der Interaktion mit Spa15 liegt. Die quantitative Untersuchung von Proteinwechselwirkungen zwischen Spa15 und OspD1 erfolgte durch die Microscale Thermophorese. Diese relativ neu entwickelte Methode beruht auf der gerichteten Bewegung von Molekülen entlang eines Temperaturgradienten, welche durch das Binden eines Liganden messbar und konzentrationsabhängig beeinflusst wird. Hier gelang es, die Wechselwirkung von Spa15 und OspD1 auf einen KD von etwa 40 nM zu determinieren. Danach wurden die verschiedenen OspD1-Peptide mit Spa15 vermessen, um zu ermitteln, wie gut die einzelnen Peptide binden und wie hoch der Verlust der Bindungsstärke im Vergleich zum obengenannten KD Volllängenprotein war. Desweiteren war es mit dieser Methode möglich, die im Rahmen von Christian Hasewinkels Dissertation angefertigten MxiE-Peptide mit OspD1 zu vermessen und dabei eine Bindung bei einem KD von 100 nM und 500 nM für zwei MxiE Peptide zu detektieren. Ebenso wurde die Bindung von MxiE- und IpaCPeptiden an das Chaperon IpgC untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit wurden ebenfalls Kristallisationsversuche mit jeweils den beiden bindungsstärksten Peptiden unternommen. Nach Optimierung der dabei gefundenen Kristallisationsbedingungen wurde ein Datensatz mit einer Auflösung von 2,6 Å erhalten. Nach Lösung der Struktur konnte allerdings kein Peptid in der Kristallstruktur gefunden werden. Zur weiteren biochemischen Charakterisierung von IpgC wurde die Fragmentbibliothek der AG Klebe (über 360 Fragmente) mit Hilfe des Thermal Shift Assays vermessen. Hierbei konnte kein Fragment ermittelt werden, welches zu einer signifikanten thermischen Stabilisierung von IpgC führte.

Summary:
Many gram-negative bacteria, including Shigella flexneri, use a type III secretion apparatus (T3SA) serving the secretion of bacterial proteins into eukaryotic cells. These proteins enable bacteria to infect eukaryotic cells. About 20 structural proteins and chaperones encoded by the mxi-spa-operon are needed to form the T3SA. The so-called "early genes" of the Shigella virulence plasmid obtain information for the synthesis of the structural proteins of the T3SA and invasins. They are regulated by VirF. The "later read-off genes" of the plasmid ensure that the host cell remains alive and are transcriptionally regulated by MxiE. Their transcriptional activation is achieved by activating the T3SA. The main focus of this thesis lies on the pathogenicity factor OspD1. The interaction of OspD1 with the chaperone Spa 15 and the transcriptional regulator MxiE was investigated biochemically and by X-ray crystallography. Within this thesis, an improved expression system was established which enables the purification via the maltose-binding protein-tag and finally results in pure OspD1 protein. After extensive attempts crystallization conditions (at 4 °C) were found which enable crystal growth of OspD1. The following improvement of the crystallization condition leads to a native data set of 2.34 Å. Unfortunately, the structure of OspD1 could not be solved within the scope of this thesis. Attempts to solve the structure by molecular replacement were not successful due to the absence of a suitable structural model with sufficient homology. Subsequent extensive efforts using heavy metal derivatives resulted in several datasets, which however, could not be evaluated. The constructed selenomethionine derivative, which in general enables structure elucidation using multi-wavelength anomalous diffraction (MAD), was expressed successfully but could not be purified. In order to crystallographically characterize the interaction of Spa15 with OspD1, co-crystallization experiments of the complex as well as crystallisation attempts of Spa15 with synthesized OspD1peptides of different length were conducted. The quantitative studies of protein interactions between Spa15 and OspD1 were performed by microscale thermophoresis. This relatively new method is based on the directed movement of molecules along a temperature gradient, which is influenced in a measurable and concentration-dependent manner by the binding of a ligand. For interaction of Spa15 with OspD1 a KD of about 40 nM was determined. Thereafter, various OspD1 peptides were measured with Spa15 to investigate the binding of individual peptides and determine the loss of the binding strength compared to the full-length protein. Furthermore, this method was used to investigate the binding of the MxiE peptides. In addition, the binding of MxiE and IpaC peptides to the chaperone IpgC was tested by microscale thermophoresis and co-crystallization experiments were conducted with the most potent peptides. Within this thesis, it was possible to find and improve crystallization conditions which results in a dataset with a resolution of 2.6 Å measured at BESSY in Berlin. However, no peptide was found in the refined crystal structure. For the biochemical characterisation of IpgC, the fragment library of the AG Klebe, consisting of over 320 fragments, was screened against IpgC utilizing the thermal shift assay. Within this project, it was investigated whether individual fragments have the potential to bind to IpgC.


* Das Dokument ist im Internet frei zugänglich - Hinweise zu den Nutzungsrechten