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Titel:From Active-Site Mapping to Lead Discovery using Fragment-based Approaches on the Aspartic protease Endothiapepsin
Autor:Radeva, Nedyalka
Weitere Beteiligte: Klebe, Gerhard (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2016
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2017/0068
DOI: https://doi.org/10.17192/z2017.0068
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2017-00684
DDC: keine Angabe
Titel(trans.):From Active-Site Mapping to Lead Discovery using Fragment-based Approaches on the Aspartic protease Endothiapepsin
Publikationsdatum:2017-02-07
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Fragment, Dynamische kombinatorische Chemie, Screening, Dynamic combinatorial chemistry, Screening, Fragment, X-Ray crystallography, Röntgenkristallographie

Summary:
The work focuses on the evaluation and comparison of different fragment-based approaches, for which purpose the model system Endothiapepsin (EP) has been used. The enzyme belongs to the family of aspartic proteases. We used the 361-entry in-house fragment library compiled with physico-chemical properties similar to the rule-of-three. We applied six different techniques to screen the fragment library: saturation-transfer difference NMR (STD-NMR), thermal shift assay (TSA), reporter-displacement assay (RDA), microscale thermophoresis (MST), fluorescence-based biochemical assay (HCS), and native mass spectrometry (MS). Alarmingly, the overlap between the hits produced by all six methods was very low. While only 41 out of all 361 fragment library entries could be identified by at least two methods, only 3 were identified by five methods, and no single fragment was identified as hit by all six methods taken together (chapter 2). We thus performed X-ray crystallography with individual fragments soaked to beforehand prepared apo EP crystals. For this purpose very high fragment concentrations of 90 mM were used. Intriguingly, we were able to identify 71 fragment hits as bound to EP, corresponding to 20% hit rate. Worryingly, only 30% of the 71 hits were predicted by only one of the beforehand applied screening techniques, clearly emphasizing that any screening strategy comprising at least two prescreening methods would have been able to identify only 19 (27%) of the 71 crystallographic hits. We divided the hits into two main groups: catalytic dyad binders and remote binders. Chapter 3 deals with the catalytic dyad binders. Therein we describe a variety of warheads which address the catalytic aspartates either directly or via the catalytic water molecule W501, while occupying the S1 and S1’ binding pockets. Furthermore, we found fragments, which occupied both pockets simultaneously, offering an optimal platform for further optimization strategies into both directions. The very useful information regarding preferred spots of binding remote from the catalytic dyad is described in detail in chapter 4. The so called hot spots represent key pocket residues, which have to be addressed in an optimization procedure in order to achieve optimal ligand binding. The high-throughput potential of X-ray crystallography (chapters 3 and 4) compared to the other six prescreening techniques presented in chapter 2 is still very low. Because of this, a lot of effort has been invested in academia and industry to extend the method’s applicability as a primary screening technique. Whenever used as such, practitioners exposed protein crystals to a mixture of compounds to accelerate the hit identification. However, we cannot recommend the use of cocktail experiments with clear conscience as we believe that parameters such as compound solubility, chemical reactivity, and crystal damage, often resulting in reduced ligand occupancy, diffuse electron density, or deviating fragment binding poses are provoked by the presence of multiple compounds in a mixture. These issues are exemplified in chapter 5 where we directly compared the difference electron density in the binding pocket of EP between singly soaked fragments and cocktails prepared those. For example, many of the fragments used in a mixture of two failed to be identified as hits, whereas clear density around those fragments could be observed in the single soaking experiments. Moreover, the clear assignment of a fragment to diffuse electron density usually requires additional experiments, which confirm the binding site. When considering this, even more time has to be spent, which extremely slows down the hit identification procedure. The only plausible reason to use several compounds in a mixture is when the reaction between those is aimed. This is an approach named dynamic combinatorial chemistry (DCC) and described in chapter 6. The compounds, hydrazides and aldehydes, chosen for the mixtures react with one another with dehydration to larger acylhydrazones. The formation of the strongest binders among others, acylhydrazones (S)-H4-A4 and (R)-H3-A5, was induced by the natural selection by the target protein EP. Moreover, in a follow-up optimization project, which started based on the binding modes of the two acylhydrazones, the combination of a bis-aldehyde with hydrazides resulted in the natural selection of a bis-acylhydrazone by EP, with an 240-fold improved potency compared to the initial acylhydrazones.

Zusammenfassung:
Die Arbeit beruht auf der Auswertung und dem Vergleich verschiedener, fragmentbasierter Verfahren, für welche Zwecke das Modelprotein Endothiapepsin (EP) verwendet wurde. Das Enzym gehört zu der Familie der Aspartylproteasen, deren Vertreter in die Pathogenese schwerer Krankheiten wie Malaria, Alzheimer, AIDS, Bluthochdruck, und Pilzinfektionen involviert sind. Eine interne Fragmentbibliothek wurde verwendet, die 361 Fragmente enthält und die auf der Grundlage von physikalisch-chemischen Eigenschaften ähnlich der Astex rule-of-three basiert. Um diese zu durchmustern, wurden sechs verschiedene Screeningmethoden angewendet: Sättigungstransferdifferenz mit Kernspinresonanz (STD-NMR), thermal shift Assay (TSA), Reporterverdrängungsassay (RDA), Thermophorese (MST), ein fluoreszenzbasierter biochemischer Assay (HCS), und Massenspektrometrie (MS). Im Allgemeinen haben die RDA und HCS Assays eine vergleichbare Anzahl an Hits gezeigt (50 (RDA) gegenüber 56 (HCS)). Jedoch ist die Anzahl der Hits für die TSA und MS Assays drastisch geringer (25 (TSA) gegenüber 8 (MS)), obwohl die Gesamtzahl der verwendeten Fragmente in allen vier Assays sehr ähnlich war (325 (RDA), 358 (HCS), 330 (TSA), und 342 (MS)). Auffällig ist allerdings die geringe Überlappung der Hits, die von jeder der sechs Methoden detektiert wurden. Während nur 41 von 361 Fragmenten in der Bibliothekdatenbank von mindestens zwei Methoden detektiert werden konnten, waren es nur drei, die von fünf Methoden und kein einziges Fragment, welches von allen Methoden gleichzeitig detektiert wurde (Kapitel 2, Abb. 2.1). Aus diesem Grund wurde jedes der 361 Fragmente einzeln in apo EP-Kristalle diffundiert um mit den hieraus erhaltenen Daten eine Röntgenstrukturanalyse durchzuführen. Hierfür wurde eine sehr hohe Fragmentkonzentration von 90 mM verwendet. Interessanterweise konnten 71 gebundene Fragmente detektiert werden, was einer Hitrate von 20% entspricht. Auffallend war allerdings die Tatsache, dass nur 30% der 71 Hits von maximal einer der sechs zuvor durchgeführten Screeningmethoden detektiert werden konnten. Dies stellt deutlich heraus, dass jede Screeningkaskade, bestehend aus mindestens zwei Methoden, nur 19 (27%) der 71 kristallographischen Hits detektiert hätte. Dies hätte zur Folge gehabt, dass 73% der 71 kristallographischen Hits nicht als solche erkannt worden wären. Die Treffer wurden in zwei Hauptkategorien aufgeteilt: direkt- und fernbindende Fragmente. In Kapitel 3 wurden die Direktbinder behandelt. Dort wurde eine Vielzahl von Kopfgruppen beschrieben, die die katalytische Dyade entweder direkt oder über das katalytische Wasser W501 adressieren, während sie die S1 und S1‘ Bindetaschen besetzen. Darüber hinaus wurden Fragmente gefunden, die beide Bindetaschen gleichzeitig besetzen, was eine optimale Grundlage für Optimierungsstrategien in die benachbarten Taschen auf jeder Seite der katalytischen Aspartate bietet. Bindestellen abseits der katalytischen Dyade wurden in Kapitel 4 beschrieben. Die so genannten „hot-spots“ stellen wichtige Aminosäuren dar, die in einem Optimierungsprozess adressiert werden sollen, um optimale Ligandbindung zu erzielen. Das Durchsatzpotenzial der Röntgenstrukturkristallographie (Kapitel 3 und 4) verglichen mit den anderen sechs in Kapitel 2 beschriebenen Screeningverfahren, ist noch sehr gering. Es wird oft eine Mischung aus Verbindungen in Proteinkristalle diffundiert um die Hitidentifizierung zu beschleunigen. Dieses Verfahren können wir jedoch nicht empfehlen, da wir glauben, dass Parameter wie Löslichkeit, Reaktivität zwischen den Verbindungen, kompetitive Bindungsposen, und Kristallschäden durch die Mehrzahl an Verbindungen in einer Mischung stark beeinflusst werden. Probleme solcher Art sind in Kapitel 5 dokumentiert, in dem die Differenzelektronendichte zwischen einzeln gesoakten Fragmenten und Cocktails aus diesen direkt miteinander verglichen werden. Der einzig plausible Grund für die Verwendung mehrerer Verbindungen in einem Cocktail ist eine beabsichtigte Reaktion zwischen einzelnen Komponenten. Dieses Verfahren wird dynamische kombinatorische Chemie (DCC) genannt und in Kapitel 6 beschrieben. Als Verbindungen für die Mischung wurden Hydrazide und Aldehyde gewählt, die in einer Kondensationsreaktion zu Acylhydrazonen reagieren. Die Bildung der stärksten Liganden, die Acylhydrazone (S)-H4-A4 und (R)-H3-A5, wurde durch natürliche Selektion veranlasst, da das Zielprotein EP solche potenten Binder aus dem Mischungsgleichgewicht zieht. In einer Folgestudie erfolgte basierend auf den Bindungsmodi der zwei Acylhydrazone die Kombination von einem bis-Aldehyd mit Hydraziden und hieraus die natürliche Selektion eines bis-Acylhydrazones durch EP. Das auf diese Weise identifizierte bis-Acylhydrazon wies eine 240-fach höhere Affinität im Vergleich zu den ursprünglichen Acylhydrazonen auf, resultierend in einem zweistellig nanomolaren Binder.


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