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Titel:One ring to rule them all : Identification and characterization of the type IV pili secretin associated protein TsaP and analysis of the type IV secretion system of Neisseria gonorrhoeae
Autor:Siewering, Katja
Weitere Beteiligte: Søgaard-Andersen, Lotte (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2014
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2017/0048
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2017-00483
DOI: https://doi.org/10.17192/z2017.0048
DDC: Naturwissenschaften
Titel(trans.):Ein Ring sie zu knechten : Identifizierung und Charakterisierung des type IV Sekretin assoziierten Proteins Tsap und Analyse des type IV seketions Systems von Neisseria gonorrhoeae
Publikationsdatum:2017-01-12
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Neisseria gonorrhoeae, secretin, type iv secretion system, Neisseria gonorrhoeae, pili, Pili, typ IV Pili, Sekretion, type IV pili

Summary:
Over the years, N. gonorrhoeae has evolved and acquired different mechanisms to protect itself against a variety of antibiotics and chemotherapeutic agents. One reason for the rapid spread of antibiotic resistance in gonococci is the highly effective horizontal gene transfer. The transferred DNA is either provided directly via conjugation, or via the environment via autolysis or the gonococcal type IV secretion system (T4SS), which secretes ssDNA into the extracellular milieu. DNA uptake from the environment in Neisseria involves the type IV pili (T4P) and the competence system, transporting the DNA across the outer and the inner membrane, respectively. Functional characterization of the type IV secretion system and DNA uptake system and thus the type IV pili machinery in N. gonorrhoeae could provide starting points in the exploration of new therapeutic strategies. To better understand the transcriptional regulatory network of the type IV secretion system of N. gonorrhoeae transcriptional mapping of genes essential for DNA secretion was performed. This revealed that genes essential for DNA secretion are encoded within four different operons. Additional analysis of a region, which is not essential for DNA secretion, encoding the single-stranded DNA binding protein SsbB and the topoisomerase TopB showed that these genes are significantly more highly transcribed then genes that are involved in DNA secretion, such as the coupling protein TraD and the relaxase TraI. To investigate whether the single-stranded DNA, which is secreted via the T4SS encoded within the GGI facilitates biofilm formation, biofilm formation of N. gonorrhoeae strains were analyzed in continuous flow-chamber systems by confocal laser scanning microscopy. This showed that the ssDNA secreted via the T4SS plays a role in the early stages of biofilm formation. In Neisseria gonorrhoeae, the native PilQ secretin ring embedded in OM sheets is surrounded by an additional peripheral structure, consisting of a peripheral ring and seven extending spikes. To unravel proteins important for formation of this additional structure, we identified proteins that are present with PilQ in the OM. One such protein, which was named TsaP, the T4P secretin-associated protein, was identified as a widely conserved component that co-occurs with genes for T4P in Gram-negative bacteria. TsaP contains an N-terminal carbohydrate-binding lysin motif (LysM) domain and a C-terminal domain of unknown function. In N. gonorrhoeae, lack of TsaP results in the formation of membrane protrusions containing multiple T4P, concomitant with reduced formation of surface-exposed T4P. Lack of TsaP did not affect the oligomeric state of PilQ, but resulted in loss of the peripheral structure around the PilQ secretin. TsaP binds peptidoglycan and associates strongly with the outer membrane in a PilQ-dependent manner. In addition, we identified that TsaP contains apart from the LysM domain, two FlgT-like domains and a linker region, which is specific for Neisseria spp. We could show that the linker domain plays an important role in pilus biogenesis in the β-proteobacterium N. gonorrhoeae. In order to determine if TsaP directly interacts with PilQ via the B2 domain, PilQ and TsaP of N. gonorrhoeae and M. xanthus were heterologously expressed and purified. Characterization of the heterologously expressed and purified proteins showed that TsaP is able to form SDS-stable complexes, resembling a ring-like structure, and that it might interact with PilQ, forming a double ring structure. In general, we propose that TsaP anchors the secretin to the PG to enable the secretin to withstand the forces generated during pilus extension and retraction. Because T4P play an important role in the pathogenesis of many bacteria and TsaP is found in all bacteria that express T4aP and plays an important role in T4aP biogenesis, it might be an important future drug target.

Zusammenfassung:
Im Laufe der Jahre hat Neisseria gonorrhoeae verschiedene Mechanismen entwickelt, um sich gegen eine Vielzahl von Antibiotika und Chemotherapeutika zu schützen. Die Hauptursache für diese rasche Ausbreitung von Resistenzen ist ein sehr effizienter horizontale Gentransfer. Die zu transferierende DNA wird dabei entweder mittels Konjugation direkt übertragen oder durch Autolyse der Gonokokken bzw. durch Sekretion von Einzelstrang DNA durch ein Typ-IV-Sekretionssystem (T4SS) an das extrazelluläre Milieu abgegeben. Die Aufnahme von DNA aus dem extrazellulären Milieu erfolgt in N. gonorhoeae durch Typ-IV-Pili (T4P) sowie das Kompetenz-System, welche DNA über die äußere und die innere Membran transportieren. Die funktionelle Charakterisierung des Typ-IV-Sekretions¬systems und des DNA-Aufnahme-Systems und somit der Typ-IV-Pili-Maschinerie könnte neue Anhaltspunkte für die Entwicklung therapeutischer Strategien liefern. Um das Transkriptionsnetzwerk des Typ-IV-Sekretionssystems in N. gonorrhoeae besser zu verste¬hen, wurden die für die DNA-Sekretion essentiellen Gene transkriptionell kartiert. Dieser Ansatz ergab, dass diese Gene in vier verschiedenen Operons enthalten sind. Die Analyse einer für die DNA-Sekretion nicht essentiellen Region, welche für das Einzelstrang-DNA bindende Protein SsbB sowie die Topoisomerase TopB kodiert, zeigte ferner, dass diese Gene signifikant höher exprimiert wurden als die an der DNA-Sekretion essentiell beteiligten Gene. Um zu untersuchen, ob die Einzelstrang-DNA, welche über das T4SS sekretiert wird, die Bildung von Biolfilm erleichtert, wurde die Fähigkeit verschiedener N. gonorrhoeae-Stämme zur Biofilm-Bildung mittels konfokaler Laser Scanning-Mikroskopie untersucht. Diese Analysen zeigten, dass die durch das T4SS sekretierte Einzelstrang-DNA eine Rolle in den frühen Stadien der Biofilmbildung spielt. In N. gonorrhoeae ist der in der äußeren Membran lokalisierte und durch PilQ gebildete Sekretin-Ring von einer zusätzlichen periphere Struktur umgeben. Diese besteht aus einem peripheren Ring und sieben davon ausgehenden Zacken. Um Proteine zu identifizieren, die für die Bildung der peripheren Struktur wichtig waren, wurden Proteine analysiert, die mit PilQ in der äußeren Membran lokalisiert sind. Durch dieses Vorgehen konnte ein Protein, das TsaP, kurz für Type-IV-Pilus-Sekretin-assoziiertes Protein, genannt wurde, als stark konservierte T4P-Komponente identifiziert werden. TsaP enthält ein N-terminales Kohlenhydrat bindendes Lysin-Motiv, auch als LysM-Domäne bekannt, und eine C-terminale Domäne mit unbekannter Funktion. In N. gonorrhoeae resultierte die Deletion von TsaP in der Bildung von Membranausstülpungen, die mit einer verminderten Bildung von oberflächenexponierten T4P einherging. Ferner konnte gezeigt werden, dass eine Deletion von TsaP keinen Einfluss auf den oligomerisations Zustand von PilQ hatte, jedoch zu einem Verlust der peripheren Struktur um PilQ führte. Weitere Analysen zeigten, dass TsaP an Peptidoglycan band und in Abhängigkeit von PilQ mit der äußeren Membran assoziierte. Darüber hinaus konnten neben der LysM-Domäne zwei FlgT-ähnliche Domänen und eine Linker-Region, die spezifisch für Neisseria spp. ist, ermittelt werden. Wir konnten zeigen, dass die Linker-Domäne in N. gonorrhoeae eine wichtige Rolle bei der Pilus-Biogenese spielte. Um festzustellen, ob TsaP direkt mit der B2-Domäne von PilQ interagierte, wurden TsaP und PilQ von N. gonorrhoeae und M. xanthus heterolog überexprimiert und gereinigt. Die Charakterisierung dieser Proteine zeigte, dass TsaP in der Lage war, SDS-stabile Komplexe zu bilden, welche eine ringförmige Struktur aufwiesen, und dass TsaP wahrscheinlich durch Interaktion mit PilQ eine Doppelringstruktur bildete. Wir vermuten, dass TsaP durch direkte Protein-Protein-Interaktion mit PilQ den Sekretin-Ring in der Peptidoglycan-Zellwand verankert und es dem Sekretin-Ring dadurch ermöglicht, den während der Pilus-Bildung und -Retraktion erzeugten Kräfte standzuhalten. Da T4P eine wichtige Rolle für die Pathogenität vieler Bakterien spielen und TsaP in Bakterien, die T4aP exprimieren, vorkommt und eine wichtige Funktion bei der T4aP-Biogenese hat, könnte TsaP einen neuen Angriffspunkt für zukünftige therapeutische Strategien darstellen.


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