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Zusammenfassung:
Unter den in der Natur üblichen Kettenmolekülen fallen Lassopeptide mit ihrer räumlichen Struktur aus der Rolle. Sie weisen eine cyclische Anordnung auf, die räumlich einem Lasso gleicht und in der Biosynthese unter Verwendung von Enzymen ausgebildet wird. Die Synthese solcher Strukturen stellt eine große Herausforderung in der organisch-synthetischen Chemie dar und konnte bis heute nicht erfolgreich durchgeführt werden. Um die Energiebarriere dieses Cyclisierungsprozesses zu verringern und das Verhältnis zwischen Ring und Kette im Gleichgewicht zu analysieren wurde die Cyclisierung reversibel gestaltet. Dies erfolgte mittels der Substitution einer Amidbindung durch eine Imin- oder Oxim-Bindung, welche die irreversible Macrocyclisierung eines Peptids in einen reversiblen Prozess transformiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden bioorthogonale Synthesemethoden für C terminale und Seitenketten-Peptidaldehyde entwickelt und die Cyclisierungstendenz dieser Peptide sowie die räumliche Anordnung der im Gleichgewicht entstehenden Produkte mittels NMR-Spektroskopie in wässriger Lösung untersucht. Mittels NMR-basierter, molekularer Modellierung wurden die Peptide analysiert und entsprechende Strukturen berechnet. Die Cyclisierungstendenz von C-terminalen Peptidaldehyden wurde im Rahmen des cyclischen Hexapeptids Segetalin A NMR-spektroskopisch untersucht und entgegen der erwarteten Kopf-zu-Schwanz-Cyclisierung eine Seitenketten-Cyclisierung über das NH-Indol des Tryptophans beobachtet. Neben Segetalin A wurden weitere cyclische Hexapeptide reversibel cyclisiert und deren Strukturen mittels NMR-Spektroskopie analysiert. Im Gegensatz zur Kopf-zu-Schwanz-Cyclisierung musste für die Kopf-zu-Seitenketten-Cyclisierung neue in der Festphasensynthese einsetzbare Bausteine entwickelt und im Multigramm-Maßstab synthetisiert werden. Für die reversible Cyclisierung von Peptidaldehyden über die Seitenkette der Glutaminsäure wurden zwei verschiedene Synthesemethoden durchgeführt und untersucht. Im Rahmen der ersten Syntheseroute, die auf einem Precursor-basierten Ansatz beruht, wurde eine Synthese der unnatürlichen Aminosäure Homoallylglycin und dessen Derivate entwickelt und die oxidative Spaltung des terminalen Olefins zum Aldehyd analysiert. Der zweite Syntheseweg beinhaltete die Synthese eines Seitenketten-Dipeptids, bestehend aus Glutaminsäure und einem geschützten Glycinaldehyd oder einem Glycinaldehyd-Precursor in der Seitenkette. Dies vereinfachte die Synthese der Aldehyd-Aminosäuren erheblich, führte zu höheren Gesamtausbeuten und ergab ein im Multigramm-Maßstab herstellbares, stabiles Aminosäure-Derivat. Die Insertion der synthetischen Aminosäure in Peptide erfolgte mittels manueller und automatisierter Festphasenpeptidsynthese. Sämtliche, auf diese Art hergestellten, Seitenketten-Peptidaldehyde wurden auf ihre Cyclisierungstendenz in wässrigem Phosphatpuffer mittels NMR-Spektroskopie analysiert. Die Einstellung des chemischen Gleichgewichts erfolgte bei pH 6.5 in wässrigem Phosphatpuffer, wodurch ein schneller H/D-Austausch stattfand und die NMR-Spektren basierend auf der Signalverbreiterung eine geringe Qualität aufwiesen. Durch reduktive Aminierung wurde die Gleichgewichtsreaktion abgefangen und es konnte gezeigt werden, dass alleine durch intramolekulare Wechselwirkungen keine Lasso-Topologie ähnlich dem Naturstoff erhalten wurde, sondern ausschließlich das cyclisch-verzweigte Peptid. Aufgrund der nicht ausreichenden Vorfaltung innerhalb des linearen Lassopeptids wurde mit Hilfe einer Disulfidbrücke das C-terminale Ende kovalent an das Rückgrat gebunden, sodass eine mögliche Macrolactamisierung des N-terminalen Rings zu einem korrekt eingefädelten Lassopeptid führen sollte. In diesem Fall wurde erneut kein topologisch korrektes Lassopeptid erhalten. Es wurde für die reversible Cyclisierung des N-terminalen Rings eine weitere Disulfidbrücke eingeführt, die die Amidbindung ersetzt, aber die native Ringgröße nicht verändert. Durch orthogonal geschützte Cysteine, die flexibel in der Primärsequenz substituiert wurden, konnten unterschiedliche Disulfidmuster synthetisiert und analysiert werden. Die synthetisierten Di- und Tetrasulfide, welche die höchste Analogie zum nativen Microcin J25 aufwiesen, wurden auf ihre biologische Aktivität untersucht. Unter Zugabe der synthetischen Peptide wurden Wachstumskurven von gram-negativen Bakterien wie Salmonella paratyphi, Shigella flexneri, Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) und Escherichia coli AS19 gemessen und die Wachstums-inhibierende Wirkung analysiert. Im Gegensatz zum nativen Microcin J25 zeigten die in dieser Arbeit synthetisierten Peptide keine ausgeprägte biologische Aktivität.

Bibliographie / References

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4. Das Peptid 10 wurde nach den allgemeinen Vorschriften der Festphasenpeptidsynthese 6.2.2
5. Das Peptid 11 wurde nach den allgemeinen Vorschriften der Festphasenpeptidsynthese 6.2.2
6. Das Peptid 14 wurde nach den allgemeinen Vorschriften der automatisierten Festphasenpeptidsynthese 6.2.5 an einem Apex 360 Synthesizer auf einem 2-CTC-Harz in einem 0.1 mM Maßstab synthetisiert. Die Abspaltung des Peptids erfolgte unter milderen Bedingungen mit der Abspaltlösung B bei 0 °C für 30 min.
7. Das Peptid 15 wurde nach den allgemeinen Vorschriften der automatisierten Festphasenpeptidsynthese 6.2.5 an einem Apex 360 Synthesizer auf einem 2-CTC-Harz in einem 0.1 mM Maßstab synthetisiert. Die Abspaltung erfolgte nach 6.2.4 mit der
8. Das Peptid 16 wurde nach den allgemeinen Vorschriften der automatisierten Festphasenpeptidsynthese 6.2.5 an einem Apex 360 Synthesizer auf einem 2-CTC-Harz in einem 0.1 mM Maßstab synthetisiert. Die Abspaltung erfolgte nach 6.2.4 mit der
9. Das Peptid 17 wurde nach den allgemeinen Vorschriften der automatisierten Festphasenpeptidsynthese 6.2.5 an einem Apex 360 Synthesizer in einem 0.1 mM Maßstab synthetisiert. Die Abspaltung erfolgte nach 6.2.4 mit der Abspaltlösung B.
10. Das Peptid 18 wurde nach den allgemeinen Vorschriften der Festphasenpeptidsynthese 6.2.2
11. Das Peptid 19 wurde nach den allgemeinen Vorschriften der Festphasenpeptidsynthese 6.2.2
12. Das Peptid 20 wurde nach den allgemeinen Vorschriften der Festphasenpeptidsynthese 6.2.2
13. Das Peptid 21 wurde nach den allgemeinen Vorschriften der automatisierten Festphasenpeptidsynthese 6.2.5 an einem LibertyBlue von CEM auf einem 2-CTC-Harz in einem 0.1 mM Maßstab synthetisiert. Die Abspaltung erfolgte mit der Abspaltlösung C in 2 h.
14. HR-MS (ESI): für C101H143N23O28H2 2+ [M+2H + ], ber.: 1047.5297, gef.: 1047.5269. [1]
15. HR-MS (ESI): für C15H27N5O8Na + [M+Na + ], ber.: 428.1752, gef.: 428.1756.
16. HR-MS (ESI): für C16H29N5O8Na + [M+H2O+Na + ], ber.: 442.1908, gef.: 442.1898.
17. HR-MS (ESI): für C16H29N5O8Na + [M+Na + ], ber.: 442.1908, gef.: 442.1910.
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21. HPLC: tR = 10.99 min (20% -70% MeCN in 30 min, 0.32 mL/min).
22. HPLC: tR = 11.38 min (20% -70% MeCN in 30 min, 0.32 mL/min).
23. HPLC: tR = 12.00 min (20% -70% MeCN in 30 min, 0.32 mL/min).
24. HPLC: tR = 12.65 min (10% -30% MeCN in 20 min, 0.32 mL/min).
25. HPLC: tR = 13.76 min (20% -70% MeCN in 30 min, 0.32 mL/min).
26. HPLC: tR = 15.64 min (20% -70% MeCN in 30 min, 0.32 mL/min).
27. HPLC: tR = 3.56 min (5% -10% MeCN in 10 min, 0.32 mL/min).
28. HPLC: tR = 3.57 min (5% -10% MeCN in 10 min, 0.32 mL/min).
29. HPLC: tR = 6.25 min (3% MeCN isokratisch, 0.32 mL/min).
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