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Zusammenfassung:
ITC-Verdrängungstitrationen und direkte ITC-Titrationen bei niedrigen c-Werten können als zuverlässige Technik verwendet werden kann, um schwache Wechselwirkungen zu untersuchen, wie sie üblicherweise für die Bindung von Fragmenten an ein Zielprotein vorkommen. Hierfür müssen jedoch einige Grundbedingungen erfüllt werden. Zuallererst ist für ITC Verdrängungstitrationen wichtig, dass das untersuchte Fragment mit einem Teil der Proteinbindetasche interagieren muss, der mit dem Bindungsbereich des verwendeten Referenzliganden überlappt. Zweitens muss der ausgewählte Referenzligand eine signifikant höhere oder niedrigere Bindungsenthalpie besitzen, so dass eine Wärmedifferenz zu dem untersuchten Fragment gemessen werden kann. Ferner ist zu beachten, dass bei jeder ITC-Verdrängungstitration, alle Fehler, die für die Referenzliganden ermittelt wurden, einen Einfluss auf die Genauigkeit der für das Fragment erhaltenen Parameter haben. Schließlich kann, wenn kein geeigneter Referenzligand zur Verfügung steht und das Fragment enthalpisch genug bindet, eine direkte Titration bei niedrigen c-Werten als Alternative verwendet werden. In diesem Fall ist jedoch ein gewisses Vorwissen über die zu erwartende Bindungsaffinität des Fragments nötig, um die erforderliche Überschuss Konzentration des Fragments am Ende der Titration abschätzen zu können. Die Löslichkeit des Fragments und des Proteins sind ebenfalls wichtige Aspekte bei der Titration mit niedrigen c-Werten, da hohe Konzentrationen des Fragments in der Injektionsspritze erforderlichen sind, um in der Probenzelle eine Konzentration des Fragments zu erreichen, die den KD-Wert des Fragments überschreitet. Daher ist eine Messung des KD-Werts des Fragments in einem unabhängigen Experiment sehr zu empfehlen, um die erforderliche Konzentration des Fragments abzuschätzen. Letztlich ist er sehr wichtig, dass die unter den verschiedenen Versuchsbedingungen gemessen Bindungsenthalpien nicht quantitativ verglichen werden sollten, sondern nur relativ zueinander durch Verwendung eines sorgfältig ausgewählten Messprotokolls. Es ist bemerkenswert, dass mit verschiedenen Referenzliganden, die für die Verdrängung der Fragmente verwendet wurden, abweichende enthalpische Signale beobachtet wurden. Wahrscheinlich wird dies durch Unterschiede in der Wasserstruktur der verschiedenen Liganden in der Bindetasche verursacht. Die Betrachtung der relativen Enthalpiedifferenzen in den verschiedenen Verdrängungsexperimenten zeigte dagegen eine konsistente relative Differenz. Dies ermöglicht es, die untersuchten Fragmente relativ zueinander zu charakterisieren. Die detaillierte Interpretation der enthalpischen Signaturen erfordert jedoch einen Vergleich der Kristallstrukturen der Fragmente. Röntgenkristallstrukturen von sechs Fragmenten, die die S1 Tasche von Thrombin adressieren und der Referenzliganden wurden bestimmt und in Bezug auf die thermodynamischen Bindungsprofile analysiert. Die Bindungsaffinität eines Liganden wird nicht nur durch die Eigenschaften des gebildeten Protein-Ligand-Komplexes bestimmt, sondern auch durch die Unterschiede von Liganden in wässriger Lösung vor Proteinbindung. Konformativ eingeschränkte Liganden können einen signifikanten Bindungsvorteil gegenüber flexiblen Liganden haben, wenn in einem rigiden Ligandgrundgerüst eine Geometrie bereits präorganisiert ist, die dem Liganden in gebundenem Zustand ähnlich ist. Ein neuer vom 3-Amidinophenylalanin abgeleiteter Matriptase Inhibitor wurde in Thrombin kristallisiert und die Röntgenkristallstruktur eines repräsentativen, verwandten Inhibitortyps in Matriptase mit dieser überlagert. Aus der Überlagerung dieser Strukturen konnten Informationen hinsichtlich der in dieser Studie beobachteten Selektivitätsprofile zu anderen Serinproteasen gezogen werden. Durch die große Homologie der mit dem Inhibitor interagierenden Aminosäuren in der Bindetasche von Thrombin und Matriptase können zudem zuverlässige Vorhersagen über den möglichen Bindungsmodus in Matriptase getroffen werden.

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