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Titel:Strukturelle und thermodynamische Charakterisierung der Fragment und Liganden Bindung an Thrombin
Autor:Rühmann, Eggert Henning
Weitere Beteiligte: Klebe, Gerhard (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2015
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2015/0481
DOI: https://doi.org/10.17192/z2015.0481
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2015-04811
DDC: Medizin
Publikationsdatum:2015-12-23
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Fragment, ligand, chrystallography, ITC, fragment, Kristallogrphie, ITC, thrombin, Thrombin, Ligand

Zusammenfassung:
ITC-Verdrängungstitrationen und direkte ITC-Titrationen bei niedrigen c-Werten können als zuverlässige Technik verwendet werden kann, um schwache Wechselwirkungen zu untersuchen, wie sie üblicherweise für die Bindung von Fragmenten an ein Zielprotein vorkommen. Hierfür müssen jedoch einige Grundbedingungen erfüllt werden. Zuallererst ist für ITC Verdrängungstitrationen wichtig, dass das untersuchte Fragment mit einem Teil der Proteinbindetasche interagieren muss, der mit dem Bindungsbereich des verwendeten Referenzliganden überlappt. Zweitens muss der ausgewählte Referenzligand eine signifikant höhere oder niedrigere Bindungsenthalpie besitzen, so dass eine Wärmedifferenz zu dem untersuchten Fragment gemessen werden kann. Ferner ist zu beachten, dass bei jeder ITC-Verdrängungstitration, alle Fehler, die für die Referenzliganden ermittelt wurden, einen Einfluss auf die Genauigkeit der für das Fragment erhaltenen Parameter haben. Schließlich kann, wenn kein geeigneter Referenzligand zur Verfügung steht und das Fragment enthalpisch genug bindet, eine direkte Titration bei niedrigen c-Werten als Alternative verwendet werden. In diesem Fall ist jedoch ein gewisses Vorwissen über die zu erwartende Bindungsaffinität des Fragments nötig, um die erforderliche Überschuss Konzentration des Fragments am Ende der Titration abschätzen zu können. Die Löslichkeit des Fragments und des Proteins sind ebenfalls wichtige Aspekte bei der Titration mit niedrigen c-Werten, da hohe Konzentrationen des Fragments in der Injektionsspritze erforderlichen sind, um in der Probenzelle eine Konzentration des Fragments zu erreichen, die den KD-Wert des Fragments überschreitet. Daher ist eine Messung des KD-Werts des Fragments in einem unabhängigen Experiment sehr zu empfehlen, um die erforderliche Konzentration des Fragments abzuschätzen. Letztlich ist er sehr wichtig, dass die unter den verschiedenen Versuchsbedingungen gemessen Bindungsenthalpien nicht quantitativ verglichen werden sollten, sondern nur relativ zueinander durch Verwendung eines sorgfältig ausgewählten Messprotokolls. Es ist bemerkenswert, dass mit verschiedenen Referenzliganden, die für die Verdrängung der Fragmente verwendet wurden, abweichende enthalpische Signale beobachtet wurden. Wahrscheinlich wird dies durch Unterschiede in der Wasserstruktur der verschiedenen Liganden in der Bindetasche verursacht. Die Betrachtung der relativen Enthalpiedifferenzen in den verschiedenen Verdrängungsexperimenten zeigte dagegen eine konsistente relative Differenz. Dies ermöglicht es, die untersuchten Fragmente relativ zueinander zu charakterisieren. Die detaillierte Interpretation der enthalpischen Signaturen erfordert jedoch einen Vergleich der Kristallstrukturen der Fragmente. Röntgenkristallstrukturen von sechs Fragmenten, die die S1 Tasche von Thrombin adressieren und der Referenzliganden wurden bestimmt und in Bezug auf die thermodynamischen Bindungsprofile analysiert. Die Bindungsaffinität eines Liganden wird nicht nur durch die Eigenschaften des gebildeten Protein-Ligand-Komplexes bestimmt, sondern auch durch die Unterschiede von Liganden in wässriger Lösung vor Proteinbindung. Konformativ eingeschränkte Liganden können einen signifikanten Bindungsvorteil gegenüber flexiblen Liganden haben, wenn in einem rigiden Ligandgrundgerüst eine Geometrie bereits präorganisiert ist, die dem Liganden in gebundenem Zustand ähnlich ist. Ein neuer vom 3-Amidinophenylalanin abgeleiteter Matriptase Inhibitor wurde in Thrombin kristallisiert und die Röntgenkristallstruktur eines repräsentativen, verwandten Inhibitortyps in Matriptase mit dieser überlagert. Aus der Überlagerung dieser Strukturen konnten Informationen hinsichtlich der in dieser Studie beobachteten Selektivitätsprofile zu anderen Serinproteasen gezogen werden. Durch die große Homologie der mit dem Inhibitor interagierenden Aminosäuren in der Bindetasche von Thrombin und Matriptase können zudem zuverlässige Vorhersagen über den möglichen Bindungsmodus in Matriptase getroffen werden.

Summary:
ITC displacement titrations and direct ITC titrations at low c-value can be used as a reliable technique to study low-affinity interactions as usually given for the binding of a fragment to a target protein. Important aspects can be concluded from this study. First of all, for ITC displacement titrations the fragment must bind to a part of the protein binding pocket that overlaps with the binding pose region of the applied reference ligand. Secondly, the selected reference ligand must have a significant higher or lower binding enthalpy so that a heat difference signal can be recorded for the fragment. Furthermore, it has to be regarded that, as for any displacement titration, all errors affecting the parameter determinations of the reference ligand will add to the accuracy of the parameters obtained for the fragment. Finally, if no suitable reference ligand is available and the fragment binds enthalpically enough, low c-value titrations can be applied as an alternative. In this case, however, some anticipated knowledge about the expected binding affinity of the fragment must be available to estimate the required excess concentration of the fragment at the end of the titration. The solubility of the fragment and the protein are the most crucial issues in low c-value titrations because the required high concentrations of the fragment to be studied in the injection syringe should exceed the final sample cell concentrations with respect to the fragment’s KD value. In order to estimate the required concentration of the fragment, a crude estimate of the fragment’s KD obtained from an independent experiment is highly recommended. It is very important that measured binding enthalpies should not be compared quantitatively across different experimental conditions, but only relative to each other by using one suitable measurement protocol. Remarkably, different reference ligands used for the displacement of pre-incubated fragments reveal deviating enthalpic signals. Most likely these differences are caused by differences in the water structure and thus in the residual solvation pattern at the binding site of the different ligands used for titration. The consideration of the relative enthalpy differences across the different displacement experiments showed a consistent relative difference. This allows to characterize the studied fragments relative to each other. The detailed interpretation of the enthalpic signature requires a comparison of the corresponding crystal structures in order to select fragments as superior enthalpy-dominated candidates for further development. To achieve this goal, high-resolution crystal structures of six fragments binding to the S1 pocket of thrombin were determined and analyzed with respect to the thermodynamic binding profiles. Binding affinity is not only determined by the properties of the formed protein-ligand complex but some differences can already discriminate ligands in aqueous solution prior to any protein binding. Conformationally restricted ligands can experience a significant binding advantage over more flexible ligands if the correct protein-bound geometry is well preorganized in a rigidified skeleton. A new derivative of a 3-amidinophenylalanine matriptase inhibitor was crystallized with thrombin and the resulting complex was superimposed with a representative X-ray crystal structure of matriptase bound to a related inhibitor. From the superimposition of these structures information could be extracted regarding the selectivity profiles towards serine proteases observed in this study. Due to the large homology of amino acids in the binding pocket of thrombin and matriptase, reliable predictions about the possible binding mode of the inhibitor, can be made for matriptase.


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