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Titel:Chemische, molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zur Biosynthese von Mykotoxinen aus Ascomyceten
Autor:Wollinsky, Beate
Weitere Beteiligte: Li, Shu-Ming (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2014
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2014/0442
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2014-04420
DOI: https://doi.org/10.17192/z2014.0442
DDC:570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.):Chemical, molecular biological and biochemical Investigations on biosynthetic enzymes of mycotoxins from Ascomycetes
Publikationsdatum:2014-12-03
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Naturstoffforschung, Kultivierung, HPLC, ascomycetes, Magnetische Kernresonanz, Heterologe Genexpression, Elektronensprayionisations-Massenspektrometrie, Schlauchpilze, HPLC

Zusammenfassung:
Zum besseren Verständnis der biologischen Diversität von Naturstoffen aus verschiedenen Mikroorganismen ist es wichtig, deren Biosynthese aufzuklären. Durch bioinformatische Analysen weiß man, dass in den meisten Fällen die Biosynthesegene aus Mikroorganismen in einem Cluster im Genom liegen. Aufgrund der Strukturen der Naturstoffe ist es demnach möglich, deren Biosynthesegene aufzudecken und zu identifizieren. Nach gelungener Identifikation der Cluster ist es nun möglich die Biosynthese gezielt zu modifizieren und somit neue Substanzen mit vorher festgelegter Struktur mittels chemoenzymatischer Synthese mit rekombinanten Enzymen oder aber auch durch genetische Manipulation in Modelorgansimen zu erhalten. Im Zuge dieser Arbeit wurde hierfür zunächst das rekombinante Protein FtmPT1 aus der bekannten Biosynthese von Verruculogen in E. coli-M15-Zelle überproduziert und mittels Ni-NTA-Agarose aufgereinigt. Zusätzlich wurden die vier Stereoisomere von cyclo Trp-Pro und cyclo Trp Ala synthetisiert, um sie später zusammen mit sechs weiteren zyklischen Dipeptiden mittels chemoenzymatischer Synthese mit FtmPT1 und DMAPP an Position C-2 zu prenylieren. In Kooperation mit Prof. Kassack aus Düsseldorf wurden die 14 chemoenzymatisch hergestellten Tryprostatin B-Analoga auf ihre Zytotoxizität gegenüber verschiedenen Zelllinien untersucht. Dabei ließ sich feststellen, dass die prenylierten Substanzen, bis auf ein paar Ausnahmen, eine ähnliche zytotoxische Aktivität gegenüber einer Zelllinie aufwiesen, wobei alle prenylierten Diketopiperazine eine deutlich höhere zytotoxische Aktivität als ihre unprenylierten Substrate aufwiesen. Dies deutet darauf hin, dass die Prenyl-Einheit essentiell für die biologische Aktivität ist, die Prolin-Einheit in Tryprostatin B dagegen nicht. Des Weiteren wiesen in den von Prof. Kassack durchgeführten Assays alle vier getesteten Stereoisomere von cyclo-Trp-Pro und cyclo-Trp-Ala ähnliche IC50-Werte gegenüber den getesteten Zelllinien auf. Dies spricht nun dafür, dass die Stereochemie an C-11 und C-14 der Diketopiperazine sowie deren Substituenten ebenfalls keinen großen Einfluss auf die Zytotoxizität nehmen. Im Zuge der Isolierung der C2-prenylierten Diketopiperazine wurden in den HPLC-Chromatogrammen zusätzliche Produktpeaks entdeckt, welche ebenfalls mittels semipräperativer HPLC isoliert wurden. Die Strukturen wurden anschließend mittels ESI-MS- und NMR-Spektroskopie als reguläre C3- und reguläre N1-prenylierte Produkte identifiziert, wobei L tryptophanhaltige zyklische Dipeptide mit FtmPT1 zu C3β-prenylierten Diketopiperazinen umgesetzt wurden und D-tryptophanhaltige zyklische Dipeptide zu C3α-prenylierten Diketopiperazinen, so dass in beiden Fällen eine syn-cis Konfiguration vorlag. Basierend auf der bekannten FtmPT1 Struktur wurden daraufhin Reaktionsmechanismen postuliert und mittels Zeitabhängigkeitsassays sowie durch Bestimmung von KM-Werten eine voneinander unabhängige Produktbildung bestätigt. Neben der chemoenzymatischen Produktion der Tryprostatin B-Analoga wurde, ebenfalls mittels semipräperativer HPLC, Fumigaclavin A aus P. commune NRRL2033 isoliert. Durch Aufklärung der Stereochemie mittels NOESY-Spektroskopie als (8R,9S)-Fumigaclavin A konnte Pyroclavin, ebenfalls mit 8R-Konfiguration, als Vorstufe der Biosynthese von Fumigaclavin A identifiziert werden. Durch die Isolierung von Fumitremorgin A aus N. fischeri NRRL181 konnte der letzte Schritt in der Biosynthese von Fumitremorgin A in N. fischeri NRRL181 identifiziert werden. Zusätzlich zu Fumitremorgin A konnten neun weitere Naturstoffe aus N. fischeri NRRL181 isoliert und deren Struktur mittels ESI-MS-und NMR-Spektroskopie aufgeklärt werden. Hierbei handelt es sich unter anderem um Aszonalenin und Acetylaszonalenin, welche von einem bekannten Cluster aus N. fischeri NRRL181 synthetisiert werden. Die Vorstufen 12,13 Dihydroxyfumitremogin C, Fumitremorgin B und Verruculogen in der Biosynthese von Fumitremorgin A wurden ebenfalls isoliert. Neben diesen sechs Indolalkaloiden mit bekannter Biosynthese wurden vier weitere Alkaloide des Fumitremorgin-Typs aus N. fischeri NRRL181 isoliert, deren Biosynthese zu Beginn dieser Arbeit noch nicht aufgeklärt werden konnte. Hierbei handelt es sich um Verruculogen TR-2, Spirotryprostatin A, 6 Methoxyspirotryprostain B und Substanz 15, wobei Spirotryprostatin A und 6 Methoxyspirotryprostain B zum ersten Mal aus N. fischeri NRRL181 isoliert werden konnten und es sich bei Substanz 15 um einen neuen Naturstoff handelt. Da die Prenyltransferase FtmPT3, anders als erwartet, nicht im Biosynthesecluster von Verruculogen identifiziert wurde, sondern auf einem anderen Chromosom, wurde vermutet, dass die benachbarten Gene von FtmPT3 für die Biosynthese der im Rahmen dieser Arbeit isolierten Verbindungen aus N. fischeri NRRL181 verantwortlich sein könnten. Deswegen wurden drei Gene ausgesucht, welche mittels PCR aus gDNA bzw. cDNA amplifiziert und anschließend in verschiedene Expressionsvektoren (pQE60, pQE70, pHis8, pYES2/NT C) kloniert wurden. Durch heterologe Genexpression in E. coli- bzw. S. cerevisiae-Zellen und Aufreinigung der überproduzierten Proteine konnten verschiedene Enzymassays mit unterschiedlichen Cofaktoren und Substraten durchgeführt werden. Jedoch konnte in keinem der getesteten Assays ein Produktpeak mittels analytischer HPLC detektiert werden. Zusätzlich sollte durch Transformation des Prenyltransferasegenes brePT in den Modelorganismus A. nidulans CaW03, in welchen bereits die NRPS FtmPS ektopisch integriert wurde, eine in vivo Produktion von Deoxybrevianamid E mittels HPLC detektiert werden. Dieser letzte Schritt der biologischen in vivo Synthese von Deoxybrevianamid E konnte jedoch nicht erfolgreich durchgeführt werden.

Summary:
To understand the biological diversity of natural products produced by different microorganism, it is very important to elucidate the biosynthesis of these products. In most cases, the biosynthetic genes are located as a cluster on the genome and can be identified by bioinformatic approaches. Based on the structure feature of natural products, it is possible to find the biosynthetic gene cluster in the genome sequence. After successful identification of a cluster in the genome sequence, it is possible to modify the original biosynthesis by chemoenzymatic synthesis or by genetic manipulations. For that purpose, FtmPT1 in the biosynthesis of verruculogen was overproduced in E. coli M15 cells and purified with Ni-NTA-Agarose. In addition, the four stereoisomers of cyclo-Trp-Pro and cyclo-Trp-Ala were synthesised by chemical synthesis. These and further six cyclic dipeptides were subsequently incubated with the overproduced prenyltransferase FtmPT1, resulting in the formation of regularly C2-prenylated derivatives. These chemoenzymatically produced diketopierazines were tested in cooperation with Prof. Kassack from Düsseldorf for their biological activities with their non-prenylated precursors as controls. The results showed that the cytotoxic effects of the prenylated diketopierazines were significant higher than those of the non-prenylated precursors. This seems that the prenyl moiety, rather than the prolin moiety is essential for the biological activity. In addition, all tested stereoisomers of cyclo-Trp-Pro and cyclo-Trp-Ala showed comparable cytotoxic activities towards the tested cell lines. So the stereochemistry at C-11 and C-14 and the corresponding substituents have no significant influence on the cytotoxicity. During the isolation of the C2-prenylated diketopiperazines, detailed analysis of the incubation mixtures of FtmPT1 revealed the presence of additional product peaks in the HPLC chromatograms. Seven regularly C3-prenylated hexahydropyrrolo[2,3-β] indoles and two regularly N1-prenylated diketopiperazines were isolated and identified by HR-ESI-MS and NMR analysis including HMBC, HSQC and NOESY experiments. L-tryptophan-containing cyclic dipeptides were converted to C3β-prenylated diketopiperazines and D-tryptophan containing cyclic dipeptides to C3α-prenylated diketopiperazines, so that in both cases a syn-cis configuration was generated. Based on the given crystal structure of FtmPT1, a putative reaction mechanism was proposed. The independent product formation was confirmed by time dependency assays and elucidation of KM-values. In addition to the chemoenzymatic production of tryprostatin B analoga the natural compound fumigaclavin A was isolated from Penicillium commune NRRL2033. The structure and stereochemistry of (8R,9S)-fumigaclavin A was confirmed by ESI-MS and NMR analysis including HMBC, HSQC and NOESY experiments. Isolation of fumitremorgin A from N. fischeri NRRL181 provided the evidence for its role as end product of the biosynthesis of fumitremorgins in this fungus. Furthermore nine natural products could be isolated from N. fischeri NRRL181 and identified via HR-ESI-MS and NMR analysis. First of all, the known products aszonalenin, acetylaszonalenin and the precursors of fumitremorgin A: 12,13-dihydroxyfumitremrogin C, fumitremorgin B and verruculogen. Four additional substances of the fumitremorgin-type with unknown biosynthetic pathways could be isolated from N. fischeri NRRL181. Via HR-ES-MS and NMR analysis, these compounds could be identified as verruculogen TR-2, spirotryprostatin A, 6-methoxyspirotryprostain B and compound 15. Spirotryprostatin A and 6-methoxyspirotryprostain B were first isolated from N. fischeri NRRL181 in this study and compound 15 has not been reported previously. The prenyltransferase gene ftmPT3 is not located in the known verruculogen-cluster at chromosome 8, but at a different chromosome. It was therefore speculated that the genes around ftmPT3 could be responsible for the biosynthesis of verruculogen TR-2, spirotryprostatin A, 6-methoxyspirotryprostain B or compound 15. Three genes were therefore amplified by PCR from gDNA or cDNA and were cloned into expression vectors (pQE60, pQE70, pHis8, pYES2/NT C). After heterologous gene expression in E. coli or S. cerevisiae and purification of the recombinant proteins, enzyme assays with different substrates and cofactors were carried out; unfortunately, no additional product peak could be detected in the HPLC chromatograms of the enzyme assays. Transformation of the prenyltransferase gene brePT into A. nidulans TN02A7 containing the NRPS gene ftmPS, was used as a strategy for in vivo production of deoxybrevianamid E. Unfortunately, no expected product could be detected with HPLC.

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  11. 3. cyclo‐C2‐dimethylallyl‐D‐Trp‐D‐Pro (3b)
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  30. Abbildung 6‐62: HMBC‐Spektrum von cyclo‐C3β‐dimethylallyl‐L‐Trp‐L‐Tyr (13c) in CD 3 OH (600 MHz)
  31. Abbildung 6‐10: 1 H‐NMR‐Spektrum von cyclo‐C2‐dimethylallyl‐D‐Trp‐D‐Pro (3b) in CDCl 3 (500 MHz) A n h a n g | 204
  32. Abbildung 6‐61: HSQC‐Spektrum von cyclo‐C3β‐dimethylallyl‐L‐Trp‐L‐Tyr (13c) in CD 3 OH (600 MHz) A n h a n g | 230
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