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Titel:Einfluss des Transkriptionsfaktors Miz1 auf die Regulation des Autophagieprozesses in Fibroblasten
Autor:Berliner, Sophie
Weitere Beteiligte: Elsässer, Hans-Peter (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2012
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2012/0877
DOI: https://doi.org/10.17192/z2012.0877
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2012-08774
DDC: Medizin
Titel (trans.):Impact of the transcription factor Miz1 on the regulation of the autophagic process in fibroblasts
Publikationsdatum:2012-11-16
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Autophagie, Fibroblast, Autophagie, Miz1, Miz1, Miz1, Fibroblasten, Fibroblasten, Autophagy

Zusammenfassung:
Autophagie ist ein physiologischer und evolutionär hoch konservierter Prozess, bei dem zelluläre Bestandteile sequestriert und schließlich recycelt werden. Er ermöglicht es der Zelle, ihr Überleben unter Stressbedingungen zu sichern und sich veränderten Umweltbedingungen anzupassen. Hierfür werden Bestandteile des Zytoplasmas von einer Doppelmembran umschlossen, indem sich eine Phagophore bildet, die sich schrittweise verlängert und sich schließlich zu einem Autophagosom schließt. Das auf diese Weise sequestrierte zytoplasmatische Material wird einem Abbau durch lysosomale Enzyme zugeführt, indem das Autophagosom mit einem Lysosom fusioniert. An der Induktion der Autophagosomenbildung sowie an den einzelnen Reifungsschritten sind zahlreiche Proteine Autophagie-assoziierter Gene beteiligt. In Vorarbeiten gab es starke Hinweise dafür, dass der Transkriptionsfaktor Miz1 an der Regulati- on des autophagischen Prozesses beteiligt ist. Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Genexpres- sion von Miz1 durch AS-Entzug (EBSS Inkubation) induziert wird, was eine Rolle von Miz1 bei der Anpassung an nährstoffarme Bedingungen vermuten lässt. Auf morphologischer Ebene konnte die wichtige Funktion von Miz1 für den autophagischen Prozess bestätigt werden. Elektronenmikro- skopische Untersuchungen konnten einen Defekt der Reifung autophagischer Vakuolen in Zellen ohne Miz1 nachweisen. Zudem konnte gezeigt werden, dass dieser Defekt durch die Substitution von humanem Miz1 aufgehoben werden kann. Die Tatsache, dass auch eine Inkubation mit EBSS die Fähigkeit von ∆POZ Zellen zur Autophagosomenreifung wiederherstellte, legt nahe, dass der autophagische Prozess in embryonalen Fibroblasten während basaler oder stimulierter Autophagie auf unterschiedliche Art und Weise reguliert wird. Die Blockierung der Autophagosomenreifung scheint bei Autophagie-Induktion durch Miz1-unabhängige Mechanismen überwunden zu werden. Um einzugrenzen, an welchen Teilschritten des autophagischen Prozesses Miz1 beteiligt ist, wur- den Genexpressionsanalysen Autophagie-assoziierter Gene in Zellen mit und ohne funktionstüch- tigem Miz1 durchgeführt. Für die Experimente wurden embryonale Mausfibroblasten verwendet, die entweder nach dem 3T3-Protokoll immortalisiert worden waren (3T3 MEFs) oder durch einen shRNA vermittelten Knockdown von p19ARF (MEFsARF ). Die Messungen ergaben, dass die Ex- pressionen der Autophagie-assoziierten Gene Atg9b und Atg16L2 während basaler Autophagie durch Miz1 reguliert werden. Zudem gab es Anhaltspunkte, dass möglicherweise noch weitere Ge- ne des Ubiquitin-ähnlichen Konjugationssystems durch Miz1 reguliert werden könnten. Es konnte somit gezeigt werden, dass Miz1 auf molekularer Ebene einen Einfluss auf einige Teilschritte der Autophagie ausübt und zwar insbesondere auf Schritte der Reifung von Autophagosomen. Diese Ergebnisse auf Genexpressionsebene ergänzen die auf morphologischer Ebene gefundenen Hin- weise auf gravierende Defekte in Zellen während der Reifung von Autophagosomen die lediglich das trunkierte Miz1 aufwiesen. Die Initiation der Autophagie scheint nach den Ergebnissen dieser Arbeit weitgehend unabhängig von Miz1 zu verlaufen. Darauf lassen die unveränderten Genexpres- sionen von ULK1 und ULK2 in Zellen mit oder ohne Miz1 schließen. Bestätigt wurde dies zudem durch die Tatsache, dass sowohl in Zellen mit als auch in Zellen ohne Miz1 autophagische Vakuolen ausgebildet wurden. Es ist bekannt, dass Miz1 seine transkriptionelle Aufgabe in Zusammenarbeit mit verschiede- nen Partnern vollbringt. Es konnte gezeigt werden, dass Miz1 die Genexpression seines wichtigsten Partners Myc reguliert. Außerdem legen die Ergebnisse dieser Arbeit nahe, dass ARF, ein weiterer Partner von Miz1 und Myc, entscheidenden Einfluss auf Miz1 hat: ARF scheint sowohl die Genex- pression von Miz1 als auch die Expressionsregulation anderer Gene durch Miz1 zu beeinflussen. Um für zukünftige Ansätze den Einfluss von Miz1 auf die Autophagie weiter aufzuklären, ist es sinnvoll, weitere detaillierte morphologische Untersuchungen durchzuführen. Die Daten dieser Arbeit legen nahe, dass die Genexpressionsanalyse einzelner Atg-Gene für Untersuchungen akut induzierter Autophagie weniger aufschlußreich ist. Den Ergebnissen nach zu urteilen, scheint akute Autophagie nicht durch veränderte Expressionsmuster von Atg-Genen reguliert zu werden. Es wäre denkbar, dass sich als Antwort auf die EBSS Inkubation zunächst die Expression von Miz1 ändert und erst längerfristig die Expressionen Autophagie-assoziierter Gene angepasst werden. Dies würde bedeuten, dass bei Durchführung der Messungen sechs Stunden nach Autophagie-Induktion Ände- rungen der Genexpressionen von Atg-Genen nicht erfasst werden, da sie erst zu einem späteren Zeitpunkt eintreten.

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  52. Tabelle A.1: Übersicht über die Einteilung der Gene hinsichtlich der Abhängigkeit ihrer Genexpressi- on von der POZ-Domäne von Miz1 bei Kultivierung in Vollmedium. Aus Gründen einer besseren Über- sichtlichkeit werden die Begriffe " Miz1-abhängig bzw. -unabhängig " synonym gebraucht für " Abhängigkeit von der POZ-Domäne von Miz1 " . Die Gene sind in drei Gruppen eingeteilt, wobei die Gene aus Gruppe
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  86. Miz1-unabhängig und die Gene aus Gruppe 1-3 Miz1-abhängig exprimiert wurden. Für die Gene aus Gruppe 1-2 konnte eine Abhängigkeit der Genexpression von der POZ-Domäne nicht bestimmt werden. Die Genexpressionen wurden in 3T3 MEFs, in MEFs ARF , sowie in infizierten ∆POZ-Zellen von 3T3 MEFs und MEFs ARF gemessen und die Gene jeweils in eine der drei Gruppen eingeteilt. Die Zuordnung zu den Grup- pen erfolgte für 3T3 MEFs und MEFs ARF durch Vergleich der Genexpressionen in Wildtypzellen und ∆POZ- Knockoutzellen jeweils unter DMEM-Bedingungen. Die Einteilung für infizierte 3T3 MEFs und MEFs ARF erfolgte durch Vergleich der Genexpressionen in mit pB-⊘ und mit pB-Miz1 infizierten ∆POZ-Zellen eben- falls unter DMEM-Bedingungen. Für die infizierten Zellen existiert keine Gruppe 1-2, da die Auswertung der Genexpressionsmessungen auf dem Mittelwert von drei Messungen (3T3 MEFs) bzw. auf den Daten einer Einzelmessung (MEFs ARF ) beruhen. Somit war eine eindeutige Zuordnung zu Gruppe 1-1 oder 1-3 möglich.
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  122. Tabelle A.2: Übersicht über die Einteilung der Gene hinsichtlich der Regulation ihrer Expression durch EBSS. Die Gene sind in fünf Gruppen eingeteilt, wobei die Gene aus Gruppe 2-1 nicht durch EBSS reguliert wurden. Für die Gene aus Gruppe 2-2 konnte eine Regulation der Genexpression durch EBSS nicht bestimmt werden. Die Gruppen 2-3 bis 2-5 fassen die Gene zusammen, für die eine Regulation durch EBSS nachgewiesen werden konnte. Sie wurden weiter unterteilt, je nachdem ob die Regulation durch EBSS Miz1- unabhängig (Gruppe 2-3) oder Miz1-abhängig (Gruppe 2-5) erfolgte. Die Gene aus Gruppe 2-4 wurden zwar durch EBSS reguliert, eine Abhängigkeit der Regulation durch EBSS von der POZ-Domäne konnte allerdings nicht bestimmt werden. Aus Gründen einer besseren Übersichtlichkeit werden die Begriffe " Miz1-abhängige bzw. -unabhängige Regulation " synonym gebraucht für " Abhängigkeit der Regulation von der POZ-Domäne von Miz1 " . Die Genexpressionen wurden in 3T3 MEFs, in MEFs ARF , sowie in infizierten ∆POZ-Zellen von 3T3 MEFs und MEFs ARF gemessen und die Gene jeweils in eine der fünf Gruppen eingeteilt. Für die infi- zierten Zellen existieren keine Gruppen 2-2 und 2-4, da die Auswertung der Genexpressionsmessungen auf dem Mittelwert von drei Messungen (3T3 MEFs) bzw. auf den Daten einer Einzelmessung (MEFs ARF ) be- ruhen. Somit war eine eindeutige Zuordnung zu Gruppe 2-1, 2-3 oder 2-5 möglich. Die Auswertung für die nicht-infizierten Zellen beruht auf den Daten zweier Messwiederholungen. A–4
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