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Titel:Strukturmodell des Terminationsmoduls der Surfactin Synthetase
Autor:Tanovic, Alan
Weitere Beteiligte: Marahiel, Mohamed, A. (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2012
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2012/0475
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2012-04750
DOI: https://doi.org/10.17192/z2012.0475
DDC: Chemie
Titel(trans.):Crystal Structure of the Surfactin Synthetase Termination Module
Publikationsdatum:2012-05-14
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Domäne <Biochemie>, Assembly Line, Strukturverfeinerung, COM-Hand-Helix-Motiv, NRPS mode of action, Strukturmodel, Röntgen-Kleinwinkelstreuung, Kristallstruktur, Peptidsynthetasen, COM-Hand-Nelix-Motif, NRPS, Surfactin, Biochemie, NRPS, Nichtribosomale Peptidsynthetasen, Nonribosomal petide synthetase

Zusammenfassung:
Nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) zeigen, trotz der hohen Anzahl ihrer Bausteine und der somit großen Vielfalt ihrer Produkte, eine konstante strukturelle Verwandtschaft. Die NRPS‐Systeme sind modular aufgebaut, wobei definierte Domänen die einzelnen Reaktionen katalysieren. Neben den katalytischen Domänen ist die Rolle des dynamischen Peptidyl‐Carrier‐Proteins (PCP) für das Verständnis der NRPS‐Wirkungsweise entscheidend. Studien vergleichbarer Systeme zeigen, dass die das Carrier‐ Protein umgebenden Linkerregionen aus Prolin‐ und Alanin‐reichen Sequenzen bestehen, wodurch die Bildung von Sekundärstrukturen erschwert und die Dynamik dieser Domänen unterstützt wird. Erst die in dieser Arbeit durchgeführte Arretierung der dynamischen PCP‐Domäne durch rationale Mutagenese ermöglichte die Beobachtung des Kristallwachstums und somit die erste Strukturaufklärung eines vollständigen NRPS‐Moduls. Die Struktur des Terminationsmoduls der Surfactin Synhtetase (SrfACS1003A) zeigt die Interaktion der dynamischen PCP‐Domäne mit der katalytischen Kondensationsdomäne (C‐Domäne). Das SrfAC‐Strukturmodell beschreibt die erste Struktur einer DC L‐Domäne. Desweiteren konnte die Bildung einer engen Interaktion zwischen der Kondensations‐ und den zwei Subdomänen der Adenylierungsdomäne (Acore‐ und Asub‐Domäne), die als Workbench bezeichnet wird, festgestellt werden. Dabei nimmt die Asub‐Domäne eine bisher nicht beobachtete Konformation ein. Die C‐ und Acore‐Domäne repräsentieren 83% der Masse eines Elongationsmodules (C‐, A‐ und PCP‐Domäne), auf deren starrem Gerüst die dynamische Asub‐ und PCP‐Domäne interagieren. Anschließende Untersuchungen mittels der Kleinwinkel‐Streuung (SAXS) zeigten, dass diese enge Interaktion auch im solvatisierten Zustand bestehen bleibt. Somit konnte die wichtige Rolle der Workbench, auch als Modell‐System für das generelle Verständniss der NRPS‐Systeme, bestätigt werden. Die Strukturaufklärung des vollständigen NRPS‐Moduls ermöglicht die eindeutige Definition der flankierenden PCP‐Linkerbereiche. Ihre sequenzielle Analyse zeigt, dass diese Bereiche aus Prolin‐ und Alanin‐reichen Sequenzen bestehen und somit nicht zur Bildung von Sekundärstrukturen neigen. Dagegen teilt der α‐helikale Linkerbereich zwischen der C‐ und A‐Domäne nicht die Affinität zu Prolin‐ und Alaninreichen Sequenzen und ist zur Bildung von Sekundärstrukturen fähig. Zusätzlich konnte in dem SrfAC‐S1003A‐Strukturmodell die spezifische Interaktion zweier Synthetasen über ein Helix‐Hand‐Motiv gezeigt werden. Dabei interagiert die C‐terminale α‐Helix (COM‐Helix) der ersten Synthetase mit dem in die C‐Domäne integrierten Hand‐Motiv der nachfolgenden Synthetase. Dadurch ist die spezifische Erkennung der Synthetasen untereinander gewährleistet, wodurch die Synthesereihenfolge erhalten bleibt (assembly line). Durch die Kombination mit der Bidomänen‐Struktur aus TycC konnte desweiteren ein multimodulares NRPS‐Modell erstellt werden. Dieses Modell zeigt eine linksläufige Schraubachse, bei der jedes Modul entlang der Assembly‐Line um 120° gedreht ist. Weitere Untersuchungen mittels CyoEM an trimodularen NRPS‐Systemen sollen diese Modul‐Anordnung bestätigen. Neben der globalen Architektur der NRPS, zeigt das Akzeptor‐Modell auch die ersten strukturell aufgeklärten Linkerbereiche einer swinging domain. Die in dieser Arbeit erstmals aufgeklärte Struktur eines NRPS‐Moduls ermöglicht neue synthetische und chemoenzymatische Ansätze für rationales Design und protein engineering an den nichtribosomalen Peptidsynthetasen und so den Zugang zu neuen biologisch wirksamen Peptidverbindungen.

Summary:
Nonribosomal peptide synthetases (NRPSs) utilize complex regiospecific and stereospecific reactions to assemble structurally and functionally diverse peptides. Despite the large number of their components and the great diversity of products, the NRPS systems hold a close structural relationship. The NRPS systems shows a modular organisation with defined domains which catalyzing the single reactions. In addition to the catalytic domains the role of dynamic peptidyl carrier protein (PCP) is crucial for understanding of the NRPS mode of action. In this work the disruption of the PCP dynamic via serine to alanin variation or attached pantotheine derivatives and whose effect on the global structure was investigated. Freezing the PCP domain in the AH state allowed the structure determination of a complete termination module of the surfactin synthetase. This structure model shows various unique properties, describing the domain interactions between the condensation domain and PCP, the first DC L domain structure model, an artificial COM helix � COM hand motif as well as a novel orientation of the adenylation subdomain relating to the adenylation coredomain. Furthermore, the formation of a close interaction between the condensation and the two subdomains of the adenylation domain (Acore and Asub), which is called the workbench be noted. Subsequent studies using small-angle scattering (SAXS) showed that this close interaction persists even in the solvated state. This studies confirm the important role of the workbench as a model system for the general understanding of NRPS systems. By combining the structural data of the bidomain structure of TycC5-6 with the surfactin termination module SrfAC a multimodulare NRPS model can be created. This model shows a counter clockwise screw axis where each module along the assembly line ist rotated by 120� as well the complete structural model of the different linker regions. The knowledge about the NRPS organization increase the possibility of constructing active chimeric enzymes, where intact modules or even single domains are exchanged to allow the biosynthesis of novel nonribosomal peptides and facilitate the access to new biologically active peptide compounds.

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