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Titel:Biochemische Untersuchungen von Prenyltransferasen aus verschiedenen Ascomyceten
Autor:Kremer, Anika
Weitere Beteiligte: Li, Shu-Ming (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2009
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2009/0704
DOI: https://doi.org/10.17192/z2009.0704
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2009-07047
DDC:610 Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):Biochemical characterization of prenyltransferases from various ascomycetes
Publikationsdatum:2009-11-24
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Aspergillus, Prenyltransferase, Katalytische Promiskuität, Prenyltransferase, Dimethylallyl-trans-Transferase, Catalytic promiscuity, Dimethylallyl-Transferase, Aspergillus fumigatus, Aspergillus

Zusammenfassung:
Aspergillus fumigatus ist ein opportunistisch pathogener Schimmelpilz und einer der Hauptauslöser invasiver Aspergillose. Zusätzlich stellt er ein wichtiges Allergen dar. Obwohl die Pathogenität dieses Pilzes von großer Bedeutung ist, ist bis jetzt noch relativ wenig über die Grundlagen dieser Pathogenität bekannt. A. fumigatus produziert eine Vielzahl von Sekundärmetaboliten, die möglicherweise für die Pathogenität mitverantwortlich sind. U. a. bildet dieser Pilz das Epipolythiodioxopiperazin Gliotoxin, das auf Zellkulturen toxisch wirkt. Aus diesem Grund wurde spekuliert, dass Gliotoxin an der Pathogenität beteiligt sein könnte. Es kann aber nicht ausgeschlossen werden, dass noch weiterer Sekundärmetbolite einen Einfluss auf die Pathogenität von A. fumigatus haben. Es ist somit von großem Interesse, mehr über die genetischen Informationen und die Biosynthese von Sekundärmetaboliten, die eventuell als Virulenzfaktoren fungieren könnten, zu erfahren. Das Gencluster der Gliotoxinbiosynthese aus A. fumigatus ist bekannt und besteht aus insgesamt acht Genen. Aus der Genomsequenz von A. fumigatus Af293 konnte ein weiteres Cluster, das drei Gene mit signifikanten Sequenzähnlichkeiten sowohl zu gliC, gliP und gliM aus dem Gliotoxin- als auch zu sirC, sirP und sirM aus dem Sirodesminbiosynthesecluster enthält, identifiziert werden. Sirodesmin ist ein weiteres Epipolythiodioxopiperazin und wird von Leptosphaeria maculans gebildet. Sirodesmin spielt in der Phytopathogenität dieses Pilzes eine entscheidene Rolle. Das putative Gencluster aus A. fumigatus enthält insgesamt acht open reading frames, das Endprodukt des Clusters ist noch unbekannt. Neben den drei schon erwähnten Genen enthält dieses Cluster ein Gen, Afu3g12930, das für eine putative Prenyltransferase kodiert. Die kodierende Sequenz dieses Gens wurde kloniert und in Escherichia coli überexprimiert. Das Protein (7-DMATS) wurde anschließend als His6-Fusionsprotein aufgereinigt. Untersuchungen zur Substratspezifität zeigten, dass 7-DMATS eine breite Akzeptanz besaß und verschiedene aromatische Substrate prenylierte. L-Tryptophan wurde bei diesen Versuchen als Substrat mit der höchsten Umsetzungsrate akzeptiert. Dies war ein Indiz dafür, dass es sich bei dieser Prenyltransferase um eine Dimethylallyltryptophansynthase handelt. Durch Strukturaufklärung des enzymatischen Produktes konnte die Position C-7 des Indolrings eindeutig als Ort der Prenylierung nachgewiesen werden. Wie bereits erwähnt akzeptierte 7-DMATS unterschiedliche aromatische Substrate. Von den getesteten 24 Indolderivaten wurden, bis auf eine Ausnahme im Falle des 7-Methyltryptophans, alle Indolderivate von 7-DMATS akzeptiert und in ihre prenylierten Produkte umgewandelt. Strukturanalysen dieser prenylierten Indolderivate zeigte die Regiospezifität der Prenylierung. In allen Fällen katalysierte 7-DMATS die Anhängung des Prenylrestes an Position C-7 des Indolrings. Durch Optimierung der Reaktionsbedingungen konnte mit acht unterschiedlichen Indolderivaten Umsetzungsraten von 56 bis nahezu 100 % erreicht werden. Basierend auf der breiten Substratspezifität und auf den hohen Umsetzungsraten kann 7-DMATS als ein sehr gutes Werkzeug für eine chemoenzymatische Synthese von prenylierten Indolderivaten angesehen werden.

Summary:
Aspergillus fumigatus, an opportunistic pathogenic fungus, is the major reason for invasive aspergillosis and constitute also as an allergenic origin. Despite of the importance of the pathogenity of this fungus, only little is known about the background of its pathogenity. A. fumigatus produces a series of secondary metabolites which can be alone or together responsible for the pathogenity. For example, this fungus produces gliotoxin, an epipolythiodixopiperazine, which is in vitro characterised as a potent agent for cell death. For this reason it was speculated, that this mycotoxin might be involved in the pathogenesis of A. fumigatus. It is still necessary to know more about the genetic information and biosynthesis of further secondary metabolites, which might function as virulence factors. The biosynthetic gene cluster of gliotoxin has been identified in A. fumigatus. In the genome sequence of A. fumigatus Af293, an additional putative biosynthetic gene cluster containing three genes with significant sequence similarity to gliC, gliP und gliM of the gliotoxin cluster, as well as to sirC, sirP and sirM of the sirodesmin cluster could be identified. Sirodesmin is also an epipolythiodixopiperazine derivative, which is produced by Leptosphaeria maculans. Sirodesmin is implicated in the phytopathogenity of this fungus. The putative gene cluster from A. fumigatus contains in total eigth open reading frames. The end product of this cluster is still unknown. One gene in this cluster, Afu3g12930 (termed hereafter 7-dmats), which encodes for a putative prenyltransferase, could be identified. The coding region of this gene was cloned, overexpressed in Escherichia coli and afterwards the His6-fusion protein was purified. The enzyme was found to catalyse the prenylation of various aromatic substances whith the highest conversation rate for L-tryptophan. This indicated that 7-DMATS functions as a dimethylallyltryptophansynthase. Structural elucidation of the enzymatic product revealed that the prenyl moiety was attached at position C-7 of the indole moiety. As mentioned above, 7-DMATS accepted various aromatic substrates, including different tryptophan-containing cyclic dipeptides and different indole derivatives. 24 simple indole derivatives were tested and all of the substances, with an exception of 7-methyltryptophan, were accepted and converted to their prenylated products. Structural elucidation of these prenylated products proved the prenylation at position C-7 and demonstrated that 7-DMATS catalyses regiospecifically the prenylation at position C-7 of the indole moiety. Eight different indole derivatives could be prenylated with conversion rates between 56 and 100 % under optimised conditions. Based on the broad substrate specificity and the high conversation rate, 7-DMATS can be used as an effective tool for chemoenzymatic synthesis of prenylated indole derivatives. 7-DMATS is an interesting enzyme not only due its potential as a tool for chemoenzymatic synthesis, but also its catalytic promiscuity.


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