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Titel:Gerichtete Proteinevolution als Werkzeug zur Generierung funktionell und strukturell neuartiger Proteine
Autor:Garbe, Daniel
Weitere Beteiligte: Mootz, Henning D. (Professor Dr.)
Veröffentlicht:2009
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2009/0159
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2009-01592
DOI: https://doi.org/10.17192/z2009.0159
DDC:570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.):Directed protein evolution as a tool to generate functionally and structurally novel proteins
Publikationsdatum:2009-07-31
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Semi-synthetisches Protein, Semi-synthetic protein, Intein, Intein, Gerichtete Proteinevolution, Yeast two hybrid system, De-novo Bindetasche, Phage Display, Phage display, Directed protein evolution, Yeast-Two-Hybrid-System

Zusammenfassung:
Proteine mit neuartiger oder verbesserter Funktionalität sind in der Industrie und der Grundlagenforschung von großem Interesse. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden zwei Verfahren der gerichteten Proteinevolution, das Hefe-2-Hybridsystem und das Phagen-Display, verwendet und auf die Anforderungen für zwei unterschiedliche Proteine adaptiert. Im ersten Projekt sollte ein neuer Ansatz zur Generierung eines mit organischen Molekülen schaltbaren Proteins entwickelt werden. Die Bindestelle des Effektormoleküls sollte de novo im hydrophoben Kern des Modellproteins, der SH3-Domäne der c-Abl Tyrosinkinase, evolviert werden. Dazu wurde in einem ersten Schritt die kleine Aminosäure Ala4 des hydrophoben Kerns durch die sterisch anspruchsvollen Aminosäuren Val und Phe ersetzt. Nach Anpassung der Proteinfaltung durch geeignete Mutationen sollten diese Platzhalter nach Rückmutation eine Kavität für das Effektormolekül hinterlassen. Während die Val-Mutation toleriert wurde und biochemisch durch CD-Spektroskopie und in der Ligandenbindung charakterisiert werden konnte, bewirkte die Phe-Mutation offensichtlich eine Entfaltung der SH3-Domäne. Mit dem Hefe-2-Hybridsystem als Selektionsmethode wurde ein Ansatz entwickelt, um durch Proteinevolution kompensierende Mutationen zu identifizieren, die erneut zu einer stabilen Proteinfaltung führen. Es wurden Fusionskonstrukte aus der DNA-Bindedomäne LexA und der B42-Aktivatordomäne mit dem Peptidliganden und der SH3-Domäne hergestellt, sodass eine Interaktion die Transkription der Reportergene LEU2 und lacZ bewirkte. Von der SH3-Domäne wurden auf DNA-Ebene Bibliotheken hergestellt, die entweder durch epPCR oder durch Zufallsmutagenese von fünf Aminosäuren des hydrophoben Kerns (L16, I18, L24, V47 und I52) mittels einer rekursiven PCR gewonnen wurden. Nach der genetischen Selektion erhaltene Hefekolonien wurden als Kandidaten weiter untersucht. Dabei wurde in hohem Maße das Auftreten von falsch Positiven beobachtet, sodass eine Umorganisation des hydrophoben Kerns nicht erreicht werden konnte. Im zweiten Projekt wurde erstmals ein auf Phagen-Display beruhendes Selektionsschema für die Verbesserung von gespaltenen Inteinen entwickelt. Inteine sind interne Proteine, die sich aus einem Vorläuferprotein unter Verknüpfung der flankierenden Polypeptidketten (N- und C-Extein) autokatalytisch entfernen. Diese Reaktion wird als Proteinspleißen bezeichnet. In gespaltenen Inteinen müssen zunächst das N- und das C-terminale Inteinfragment (IntN bzw. IntC) assoziieren. In dieser Arbeit wurde mit dem künstlich an Position 11 sowie Position 104 gespaltenen DnaB-Intein aus Synecchocystis sp. PCC6803 gearbeitet. Mit erstgenanntem System ließe sich in Zukunft auch der Einbau eines organischer Bausteins anstelle der sterisch anspruchsvollen proteinogenen Aminosäure (vergl. Ala4Phe) im ersten Projekt realisieren. Ein IntN(104)-Fusionsprotein wurde mit dem M13-Phagen, der das komplementäre IntC-Fragment präsentierte, inkubiert und die Spleißreaktion durch Immunoblotting nachgewiesen. Anschließend wurde das IntN(104)-Fusionsprotein durch ein N-terminales Streptavidin-bindendes Peptid (SBP) an Streptavidin-Beads immobilisiert. Die aus der Spleißreaktion resultierenden SBP-Phagenpartikel konnten kompetitiv mit Biotin eluiert werden. Mit diesem Protokoll gelang es, aus einer 1:10.000 Mischung mit einem nicht spleißaktiven Kontrollphagen den Hybridphagen über fünf Selektionszyklen um den Faktor 1250 anzureichern. Für das an Position 11 gespaltene DnaB-Intein konnte ebenfalls durch Präsentation des IntC(11)-Fusionsproteins auf der Phagenoberfläche und Inkubation mit einem synthetischen IntN(11)-Fusionspeptid die Modifikation des Phagenproteins durch Protein-Spleißen gezeigt werden. Dabei wurde Desthiobiotin als N-terminale Peptidmodifikation übertragen, wodurch die Phagen an Streptavidin-Beads gebunden werden konnten. So konnte ein Protokoll etabliert werden, das in fünf Zyklen die Anreicherung des Hybridphagen aus einer 1:10.000 Mischung mit einem nicht spleißaktiven Kontrollphagen um den durchschnittlichen Faktor 290 gestattete. Schließlich wurde der Einfluss der Aminosäure an Position +2 des C-Exteins auf die Aktivität des an Position 104 gespaltenen DnaB-Inteins anhand von gereinigten Proteinen untersucht. Hierzu wurde mit einem degenerierten Oligonukleotid an jener Position eine sättigende Mutagenese durchgeführt. Neben der natürlich vorkommenden Aminosäure Ile zeigte von den untersuchten Aminosäuren vor allem Ala einen positiven Einfluss auf die Bildung des Spleißproduktes in einer in vitro Spleißreaktion, während z. B. Pro einen inhibierenden Effekt hatten.

Summary:
Proteins bearing new or improved functionalities are very important in industry and basic research. This PhD thesis deals with two directed protein evolution methods, the yeast-2-hybrid system and phage display, which were adopted to the needs of two different proteins. The aim of the first project was to develop a protein that can be artificially switched by an organic molecule. This molecule should bind in a newly created cavity established in the hydrophobic core of the model protein, the SH3 domain of the c-Abl tyrosine kinase. To this end the small hydrophobic core amino acid Ala4 was replaced in a first step by the bulky Val and Phe. Following the adaptation of the protein folding to this steric constraint, a back-mutation was intended to reveal a new cavity for binding of the organic molecule. Unlike the Phe mutant, the Val substitution was tolerated by the protein fold and allowed its biochemical characterisation by CD-spectroscopy and a peptide ligand binding assay. A protein evolution approach using a yeast-2-hybrid selection system was developed to identify compensating mutations in the A4F mutant in order to stabilize again the hydrophobic core. Fusion constructs of the B42 activator domain and the DNA binding domain LexA with the peptide ligand and the SH3 domain were created. An interaction between the SH3 domain and the ligand was necessary to promote transcription of the reporter genes LEU2 and lacZ. Two libraries of the SH3 domain were prepared on the DNA-level, one by epPCR and the other by focussed random mutagenesis of the five remaining amino acids of the hydrophobic core (L16, I18, L24, V47 and I52). Genetically selected yeast colonies were further characterised. However, it was noticed that a large number of the selected yeast cells were false positives. Hence the reorganisation of the hydrophobic core could not be accomplished. In the second project a phage display scheme to select for split inteins with improved activity was developed for the first time. Inteins are internal proteins that excise themselves in an autocatalytic fashion from a precursor protein with concomitant linkage of two flanking polypeptide chains (N- and C-extein). This reaction is referred to as protein splicing. In split inteins the N- and C-extein fragments have to associate before the splicing reaction. The object of this project was the DnaB intein from Synecchocystis sp. PCC6803, which was artificially split either at position 11 or at position 104. Protein splicing was shown between an IntN(104) fusion protein and an M13-Phage presenting the complementary IntC fragment. Subsequently, the IntN(104) fusion protein was immobilisied on streptavidin beads via its N-terminal streptavidin binding peptide (SBP). The resulting splice product (SBP-phage) could be specifically eluted from the beads with biotin. Following this protocol it was possible to enrich the hybrid-phage from a 1:10,000 mixture with a control-phage incompetent for protein splicing. After five rounds of biopanning an enrichment factor of 1,250 was obtained. In experiments with the DnaB intein split at position 11 a fairly different protocol was used. In this case, the N-terminal modification desthiobiotin of a synthetic IntN(11) peptide was transferred to the splice product, which could then be immobilized on streptavidin beads. By this protocol, an enrichment of the hybrid-phage from a 1:10,000 mixture with a control-phage by an average factor of 290 was accomplished. Finally the influence of the amino acid at position +2 of the C-extein on the splicing activity of the DnaB intein split at position 104 was examined using purified proteins. To this end a saturated mutagenesis with a degenerated oligonucleotide was applied at this position. Besides the naturally occurring isoleucine, alanine showed a positive influence, whereas Pro caused an inhibitory effect on the progress of the in vitro protein trans-splicing reaction.


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