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Titel:Identifizierung von Inhibitoren der Wachstumsarrest induzierenden Funktion von Miz1 und Charakterisierung von 14.3.3eta als Inhibitor der Funktion von Miz1
Autor:Daniela Kleine-Kohlbrecher
Weitere Beteiligte: Eilers, Martin (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2008
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2009/0040
DOI: https://doi.org/10.17192/z2009.0040
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2009-00408
DDC:500 Naturwissenschaften
Titel(trans.):Identification of inhibitors that suppress the Miz1 induced growth arrest function and characterization of 14.3.3eta as inhibitor of the Miz1 function
Publikationsdatum:2009-03-03
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Wachstumsarrest, Miz1, Growth arrest, 14.3.3eta, Miz1, Genetic screen, Genetischer Screen, 14.3.3eta, Inhibitor, c-Myc, c-Myc

Zusammenfassung:
Der mit Myc interagierende Transkriptionsfaktor Miz1 wird für die transkriptionelle Aktivierung der Cdk-Inhibitoren p15Ink4b und p21Cip1 benötigt. Durch die Aktivierung dieser Gene induziert Miz1 in Zellen einen Wachstumsarrest in der G1-Phase des Zellzyklus. Myc inhibiert die Miz1-abhängige Induktion des G1-Arrestes durch Ausbildung eines Komplexes mit Miz1, wodurch Myc die Transaktivierungsaktivität von Miz1 hemmt. In der vorliegenden Arbeit wird ein retrovirales Screen-Verfahren beschrieben, daß mit dem Ziel durchgeführt wurde neue Gene zu identifizieren und charakterisieren, die für Inhibitoren der wachstumshemmenden Funktion von Miz1 kodieren. Dazu wurde eine humane cDNA-Expressionsbibliothek retroviral in Rat1- Fibroblastenzellen infiziert, die zusätzlich mit Miz1 exprimierenden Retroviren superinfiziert wurden. Der eingesetzte Titer der Miz1 exprimierenden Retroviren, führte zu einem vollständigen Wachstumsarrest in parentalen Rat1-Fibroblasten. Die Identität der cDNA-Insertionen der erhaltenen Zellklone wurde mittels PCR-Technik und Sequenzierung ermittelt. Es wurde insgesamt siebenmal eine für c-Myc kodierende cDNA und zweimal eine für ein Fragment des gamma Actin kodierende cDNA isoliert. Es konnte in allen analysierten Zellklonen eine bestehende ektopische Expression von Miz1 nachgewiesen werden. Die Isolierung vollständiger Gensequenzen mit einer Inhibitionsfunktion demonstrieren, daß das durchgeführte Screen-Verfahren technisch gut funktioniert hat. Jedoch führte die Ermittlung der cDNAs als humane c-Myc Sequenzen als Inhibitor des Miz1 induzierten Wachstumsarrestes nicht zu neuen Erkenntnissen, da diese Interaktion bereits bekannt und untersucht war (Peukert et al., 1997). Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung von 14.3.3eta, als Inhibitor der Funktion von Miz1. Dabei handelt es sich um eine Isoform der 14.3.3 Proteinfamilie, die in Säugern insgesamt neun Mitglieder umfaßt. 14-3-3eta wurde als potentieller Kandidat in einem anderen retroviralen Screen-Verfahren gefunden, das ebenfalls zur Identifizierung neuer Inhibitoren der wachstumshemmenden Funktion von Miz1 durchgeführt wurde. Dazu wurde eine retrovirale cDNA-Expressionsbibliothek eingesetzt, um gezielt nach Inhibitoren zu suchen, die das langsame Wachstum von Zusammenfassung 124 Miz-1 überexprimierenden Rat1-Fibroblastenzellen überwinden können. Die Überexpression von 14-3-3eta hemmt den Miz1-induzierten Wachstumsarrest in der G1-Phase des Zellzyklus durch Inhibition der Miz1-abhängigen Genaktivierung der der Cdk-Inhibitoren p15INK4B und p21CIP1, ähnlich wie Myc und TopBP1. Darüber hinaus antagonisiert 14.3.3eta auch die Apoptose in Rat1-Fibroblsaten, die durch eine Überexpression von Miz1 induziert wird. Es konnten in der Sequenz von Miz1 zwei potentielle Bindemotive für die Bindung von 14.3.3 Proteinen, sogenannte Mode I Motive, ermittelt werden, die in der Nähe und innerhalb der DNA-bindenden Domäne liegen. In dem ersten Motiv befindet sich an Position 291 ein phosphorylierbares Threonin und im zweiten Motiv an Position 428 ein phosphorylierbares Serin. 14-3-3eta bindet über diese beiden Motive direkt an Miz1. Punktmutanten von Miz1, die nicht mehr an 14-3-3eta binden können, demonstrieren, daß die Hemmung der Miz1-abhängigen Genaktivierung von p21Cip1 und p15Ink4b durch 14-3-3eta von den beiden Erkennungsmotiven abhängt. Dabei ist die Hemmung von der Phosphorylierung der Aminosäuren Threonin291 und Serin428 abhängig. Mechanistisch erfolgt die Hemmung von Miz1, indem 14-3-3eta die Bindung von Miz1 an die Initiator Elemente der Zielgen-Promotoren verhindert. Die zelluläre Lokalisation von Miz1 wird durch die Interaktion mit 14-3-3eta nicht verhindert. Die Vorraussetzung der Interaktion von 14-3-3eta mit seinen Liganden ist die Phosphorylierung der Serin/ Threonin Reste in den Erkennungsmotiven. Die Phosphorylierung des Serin428 in Miz1 erfolgt durch die Akt/ PKB Kinase und ist notwendig für die Interaktion von 14-3-3eta und Miz1 und die daraus resultierende Inhibition der Funktion von Miz1. Genexpressionsanalysen zeigten, daß Miz1 zwei veschiedene Funktionen in der Regulation der Genexpression besitzt. Zum einen ist Miz1 für die nach DNASchädigung erfolgende Aktivierung einer großen Gruppe von Genen notwendig. Diese Funktion wird durch Myc, aber nicht durch Akt/ 14-3-3eta reguliert. Zum anderen reprimiert Miz1 eine Gruppe von Genen nach Schädigung der DNA. Diese reprimierende Funktion wird durch Akt/ 14-3-3eta aber nicht durch Myc reguliert. Die Akt-abhängige Phosphorylierung von Miz1 und die darauf folgende Bindung von 14-3-3eta scheint in der Regulation des Zellzyklusarrestes während der DNA-Schadensantwort eine wichtige Rolle zu spielen.

Summary:
The Myc interacting transcription factor Miz1 is required for the transcriptional activation of the cyclin dependent kinase inhibitors p15Ink4b and p21Cip1. It is through the activation of these genes that Miz1 induces a cell cycle arrest in the G1-phase of cells. Myc prevents the Miz1 dependent induction of the G1-arrest by forming a complex with Miz1 and thereby repressing the transcriptional activity of Miz1. In the presented dissertation, a retroviral screen was performed, in an attempt to both identify and subsequently characterize novel genes encoding inhibitors of the growth suppressive function of Miz1. To this end, a human cDNA library was retrovirally infected into Rat1 fibroblasts that had been additionally superinfected with Miz1 expressing retroviruses. The titer of the Miz1 expressing retroviruses caused a complete growth arrest in parental Rat1 fibroblasts. To determine the identity of the inserted cDNAs of the isolated clones, both PCR and sequencing procedures were performed. Altogether, a cDNA encoding human c-Myc was isolated seven times whilst a cDNA encoding a fragment of the human gamma actin1 was isolated twice. In all of the analysed cell clones ectopic Miz1 expression was detectable. The isolation of entire gene sequences with an inhibitory function demonstrated that the executed screening assay was technically working. However the identification of the hit cDNAs inhibiting the Miz1 induced growth arrest as being human c-Myc sequences did not precede new findings because of the already known and well studied interaction of c-Myc and Miz1 (Peukert et al., 1997). The second part of the dissertation deals with the characterization of 14-3-3eta as an inhibitor of the function of Miz1. 14-3-3eta is an isoform of the 14-3-3 protein family which contains nine family members in mammals. 14-3-3eta was found as a potential candidate in a separate retroviral screen that was also performed to identify new inhibitors of the growth suppressive properties of Miz1. In this instance, a retroviral cDNA expression library was used to find systematically inhibitors that could overcome the slow growth phenotype of Miz1 expressing Rat1 fibroblasts. Overexpression of 14-3-3eta overcame Miz1 induced growth arrest in the G1 phase of the cell cycle and inhibited transcriptional activation of the Cdk inhibitors p15Ink4b and p21Cip1 by Miz1 similar to c-Myc and TopBP1. Furthermore 14-3-3eta overexpression antagonizes the Zusammenfassung 126 Miz1 induced apoptosis in Rat1 fibroblasts. Sequence analysis of the Miz1 sequence revealed two potential binding motifs for 14-3-3 proteins. They are located close to and within the DNA binding domain of Miz1. In the first motif lies a phosphorylatable threonine at position 291 and in the second motif lies a phosphorylatable serine at position 428. 14-3-3eta binds directly to Miz1 through these two consensus binding sites. It was shown using point mutants of Miz1 which are deficient in 14-3-3eta binding show that binding of 14-3-3eta to this consensus sites is necessary to block Miz1 mediated transcriptional activation of p21Cip1 and p15 Ink4b. Furthermore, phosphorylation of the serine/ threonine residues in these recognition motifs is prerequisite for the interaction of 14-3-3 to Miz1. The inhibition of Miz1 by 14-3-3eta mechanistically functions by preventing the binding of Miz1 to the initiator elements of the target gene promoters. The interaction with 14-3-3eta had no effect on the subcellular localization of Miz1. An assumption for the interaction of 14-3-3 with its ligands is the phosphorylation of the serine/ threonine residues in the binding motifs. The phosphorylation of the serine at position 428 in the second binding motif is carried out by the Akt/ PKB kinase and is essential for the interaction of 14-3-3eta and Miz1 and the subsequent inhibition of the Miz1 function. Gene expression analysis demonstrated that Miz1 has two distinct functions in regulation of gene expression. Firstly, Miz1 is required for DNA damage induced upregulation of a large group of genes. This function is regulated by Myc but not by Akt/ 14-3-3eta. Secondly, Miz1 represses the expression of a large group of genes in response to DNA damage in an Akt/ 14-3-3eta, but not a Myc regulated manner. Akt dependent phosphorylation of Miz1 and the following binding of 14-3-3eta may thus regulate growth arrest in response to DNA damage.


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