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Zusammenfassung:
Rho-GTPasen fungieren als zentrale Schalter in komplexen Signalnetzwerken eukaryotischer Zellen. Sie sind an vielfältigen Prozessen beteiligt, wie der Regulation derGenexpression und Zellproliferation, der Organisation des Vesikelverkehrs und des Zytoskeletts. Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem Problem der Spezifitätsdetermination der Rho-GTPasen. Es existieren weitaus mehr Aktivatoren und Effektoren, als GTPasenselbst. Hinzu kommt, dass einige Effektoren von mehr als einer GTPase aktiviert werden.Dennoch muss sichergestellt werden, dass ein spezifischer Stimulus auch immer nur die zugehörige Zellantwort induziert. Trotz sehr hoher Sequenzähnlichkeit der GTPasen Cdc42 und Rac1 führen die Deletionen der entsprechenden Gene zu deutlich differenzierbaren Phänotypen in U. maydis. Durch Komplementationsstudien chimärer Konstrukten, bestehend aus verschiedenen Anteilen aus Cdc42- und Rac1-Sequenz, konnte gezeigt werden, dass die Region zwischen Aminosäure 41 und 56 notwendig und ausreichend für die Spezifitätsbestimmung der GTPasen ist. Der Austausch einer einzigen Aminosäure innerhalb dieser Region führte zu einer GTPase,Rac1W56F, die in vivo sowohl Funktionen von Cdc42 als auch von Rac1 erfüllt. Über in vitro GEF-Assays konnte gezeigt werden, dass der Aminosäureaustausch an dieser Position zur Erkennung von Rac1W56F durch den Cdc42-spezifischen GEF Don1 führt. Somit ist die Aktivierung von Rac1W56F durch Don1 der kritische Faktor, der es dieserGTPase erlaubt, Cdc42 zu ersetzen. Die beiden Rho-GEFs Its1 und Cdc24 wurden sowohl mittels GEF-Assays auf ihre Spezifität gegenüber den GTPasen analysiert als auch genetisch auf ihre zellulären Funktionen hin untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass Its1 ein Cdc42-spezifischer GEF, und Cdc24 ein Rac1-spezifischer GEF ist. Interessanterweise führt der Aminosäureaustausch an Position 56 der GTPasen ebenfalls zu einer veränderten Aktivierbarkeit durch die beiden GEFs Its1 und Cdc24. Die Analyse einer konditionalen its1-Mutante zeigte, dass dieser GEF in U. maydis essentiell ist. Sowohl die Zellwandmorphologie als auch Endozytose und Vesikelfusion sind in dieser Mutante gestört. Über quantitative „real time“-PCR konnte gezeigt werden, dass über Nutzung alternativer Polyadenylierungsstellen verschiedene Isoformen von Its1 gebildet werden, von denen nur die längere die katalytische GEF-Domäne besitzt. Über die Erstellung einer konditionalen cdc24-Mutante konnte gezeigt werden, dass Cdc24 ebenfalls ein essentieller GEF ist und die Cdc24-Überexpression über Aktivierung von Rac1 zur Bildung langer Filamente führt. Außerdem wurde in dieser Arbeit mit dem Rho-GDI Rdi1 ein weiterer Regulator der GTPasen untersucht. Interessanterweise interferiert eine rdi1-Deletion mit der Filamentbildung durch Ras1-, Rac1- und Cdc24-Überexpression, jedoch nicht mit der b-induzierten Filamentbildung, obwohl diese Rac1-abhängig ist. Dies spricht dafür, dass hier verschiedene regulatorische Mechanismen zugrunde liegen.

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