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Zusammenfassung:
Die Inzidenz von Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereiches (HNSCC) hat in den letzten Jahren stark zugenommen. Diese Tumorentität zeichnet sich durch einen invasiven Charakter, die Neigung zur frühzeitigen Metastasierung und eine schlechte Prognose aus. Um neue Therapiekonzepte zu erarbeiten ist es notwendig, die komplexen biologischen Mechanismen der Invasion und Metastasierung zu verstehen. Die Familie der zinkabhängigen Endopeptidasen, der so genannten Matrix Metalloproteinasen, repräsentiert eine Gruppe von Proteinen, die den Ab- und Umbau der extrazellulären Matrix steuern. Diese Proteinasen besetzen eine Schlüsselrolle bei der Tumorzellinvasion und bei diversen Schritten der Metastasierungskaskade. Mittels Western Blot Analyse (WB) und immunhistochemischen Methoden wurde der Expressionsstatus verschiedener MMP-Isoformen in HNSCC-Zelllinien und Tumorgeweben untersucht. Die Tumor-Stroma-Übergangszone wurde mit Hilfe histo- und zytochemischer Färbungen an HNSCC-Zelllinien und Geweben genauer betrachtet. An Co-Kulturen zweier Zelllinien konnte zudem der Einfluss der in vitro Invasivität auf die Expression (WB) und Aktivität (Gelatine Zymographie) der Gelatinase MMP-9 untersucht werden. Mit Hilfe des Electrical Resistance Breakdown Assays (ERBA) wurde die in vitro Invasivität von Zelllinien quantifiziert. Durchgeführt wurden die Versuche an 12 HNSCC-Zelllinien und 15 HNSCC-Patientengeweben. Eine Expression von MMP-1, -3, -7, -9, -11 und -15 wurde in den HNSCC-Geweben und Zelllinien mittels Immunhistochemie und WB nachgewiesen. In der immunhistochemischen Färbung zeigten neben den Tumorzellen auch Fibroblasten des umgebenden Stromas eine MMP Expression. Die als Kontrollgewebe dienende gesunde orale Schleimhaut wies im Vergleich zu den Tumorgeweben eine deutlich geringe Expression von MMPs auf. Die immunhistochemische Färbung deckte eine deutliche Überexpression von MMP-9 an der Tumor-Stroma-Kontaktzone auf. Auf Grund dieses Verteilungsmusters wurde die Rolle dieser Gelatinase in HNSCC näher untersucht. Zusätzlich wurden immunzytochemische Untersuchungen der Tumor-Stroma-Kontaktzone durchgeführt. Diese konnte in vitro durch die Co-Kultur von Fibroblasten und Tumorzellen imitiert werden. Fibroblasten der Zelllinie NIH-3T3 exprimierten MMP-9 teilweise stärker als die Tumorzelllinien. Eine gesteigerte MMP-9 Expression an der Tumor-Stroma-Interaktionszone ließ sich nur sporadisch nachweisen. Im WB konnten hingegen keine durch die Co-Kultur bedingten Veränderungen der MMP-9 Expressionsstärke gezeigt werden. Auch eine signifikante gelatinolytische Aktivität ließ sich nicht belegen. Zusätzlich wurde mit Hilfe des ERBA die Invasivität von einzelnen Zelllinien mit der von Co-Kulturen verglichen. Die Co-Kultur mit Fibroblasten resultierte allerdings in keiner Änderung des invasiven Verhaltens. Es konnte jedoch festgestellt werden, dass HNSCC-Zelllinien in vitro insgesamt weniger invasiv wachsen als in vivo. Die erhobenen Ergebnisse deuten auf eine Induktion der MMP-9 Expression an der invasiven Tumorfront in vivo hin. Diese Beobachtung legt eine Interaktion zwischen Tumorzellen und umgebenden Gewebe nahe, welche die MMP-9 Sekretion zu beeinflussen scheint. Es gelang dagegen nicht, die MMP-9 Expression durch Co-Kultur in vitro zu induzieren. Vermutlich spielen zahlreiche Faktoren aus dem umgebenden Gewebe eine Rolle bei der Invasivität, der Metastasierung und bei der Induktion der MMP-9 Expression, die durch die Co-Kultur nicht hinreichend nachzubilden waren. Diese Untersuchung trug dazu bei, den Stellenwert von MMP-9 in HNSCC weiter aufzuklären. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass MMPs sowohl in HNSCCZelllinien, als auch in Gewebeproben hoch verfügbar sind. Es zeigt sich dabei ein deutlicher Expressionsunterschied zwischen Tumor- und Kontrollgeweben, mit einer Überexpression in Tumoren. Darüber hinaus lässt sich häufig eine verstärkte MMP-9 Expression an den Tumorrändern beobachten. Dies kann als Hinweis auf eine Interaktion zwischen Tumor und umgebendem Stroma gedeutet werden und erscheint bedeutsam, da die Degradation des Gewebes und das Tumorwachstum an der invasiven Tumorfront stattfinden. Eine Induktion der MMP-9 Expression an der Tumor-StromaÜbergangszone konnte, wenn auch nur sporadisch, in Co-Kultur von Tumorzellen und Fibroblasten nachgestellt werden. Diese Tatsache zeigt, dass das Zusammenspiel multipler Faktoren sowohl aus den Tumorzellen selbst, als auch aus dem umgebenden Gewebe, Vorraussetzung für die Invasivität und Metastasierung von Tumoren ist. Um Ansätze für eine bessere Diagnostik und neue Therapien erarbeiten zu können, sollte die Tumor-Stroma-Interaktionszone in weiteren Studien genauer untersucht werden. Die Entwicklung eines spezifisch auf HNSCC-Tumoren anwendbaren Modells zur Nachbildung der Tumorzellinvasivität, ist wünschenswert, um diese Vorgänge besser verstehen zu können.

Summary:
The incidence of head and neck squamous cell carcinomas has steadily increased during the last years. This tumor entity is characertized by its invasive character, its tendency for early metastasis and its poor prognosis. To achieve an optimal treatment one needs to understand the complex biological mechanisms of invasion and metastasis. The family of zinc-dependent endopeptidases, the matrix metalloproteinases, represent a group of proteins which are capable of remodelling the extra cellular matrix. They contribute to the intra- and extravasation and to the local invasion. In this thesis the co-expression of several MMPs in HNSCC-cell lines and tissue samples was investigated using western blot and immunohistochemical methods. The tumor-stroma-interference of tumor tissues as well as HNSCC-cell lines was regarded with special interest by means of immunohistochemistry and immunozytochemistry. In addition, the influence of the in vitro invasion on the MMP-9 expression and activity was examined. For this purpose co-cultures of two cell lines were applied. The gelatine zymography was used to determine the activity of the gelatinase MMP-9. The in vitro invasion of cell lines was quantified by means of electrical resistance breakdown assay (ERBA). The experiment has been carried out on 12 HNSCC-cell lines and 15 HNSCCtissue samples. The expression of MMP-1, -3, -7, -9, -11 und -15 in HNSCC-cell lines and tissue samles was shown by immunohistochemical staining and WB analysis. The immunohistochemical analysis revealed MMP expression in tumor cells as well as in fibroblasts from the surrounding tissue. Healthy oral mucosa served as control tissue and displayed in immunohistochemical staining less MMP expression compared to the analyzed tumor tissues. Immunohistochemical staining with MMP-9 clearly indicated an increased expression at the tumor-stroma-interference. Based on this the role of the gelatinase MMP-9 in HNSCC was further investigated. Immunozytochemical analysis of the tumor-stroma contact zone, which was imitated using a co-culture of fibroblasts and tumor cells in vitro, followed. Partially NIH-3T3 fibroblasts expressed MMP-9 stronger than tumor cell lines. The immunofluorescence staining sporadically detected an increased MMP-9 expression at the tumor-stroma-interference site. However, WB analysis did not show an increased MMP-9 expression after co-culturing the HNSCCcell lines with NIH-3T3. In addition, the zymography revealed no significant gelatinolytic activity in any of the samples. The invasiveness of single cell-lines was compared to invasiveness of co-cultured cells by the means of ERBA. The co-culture with fibroblasts did not result in a change of invasiveness. It was observed that HNSCC-cell lines altogether grew less invasive in vitro than in vivo. The gained results suggest that an induction of the MMP-9 expression at the invasive tumor front is present in vivo. This observation indicates an interaction between tumor cells and the surrounding tissue, which seems to play a role in the MMP secretion. However, it could not be managed to induce the MMP-9 expression in cell lines by means of in vitro invasion. Presumably, numerous factors from the surrounding tissue play a role in the invasion, metastasis and in the induction of the MMP-9 expression, which cannot be copied sufficiently by co-culture. The present study contributed to the elucidation of the importance of MMPs in HNSCC. In summary, MMPs are expressed in HNSCC-cell lines as well as in tumor tissues. A difference in the MMP expression between tumor- and control tissue with a greater expression in tumor tissues could be observed. Furthermore, MMP-9 production seems to be intensified at the tumor margins. This can be interpreted as an evidence for an interaction between tumor cells and the surrounding tissue. The degradation of the adjacent tissue and tumor growth takes place at the aggressive tumor front. The influence of the MMP-9 expression at the invasive tumor front could - although only sporadically - be shown for co-culture of fibroblasts with tumor cells. This circumstance implies that the interaction between multiple factors from the tumor cells themselves as well as from the surrounding tissue is essential for invasion and metastasis. In order to improve diagnostic tools and therapies it is essential to explore the tumorstoma interference in further studies. The development of a feasible, lifelike model suitable for HNSCC, which is capabale of mimicing the invasion of tumor cells into surrounding healthy tissue, is desirable to increase our understanding of this process.

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