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Titel:Identifizierung und Charakterisierung von Membranproteinen der Zymogengranula: Eine Beteiligung der kleinen GTPase Rab8A an der Granulabildung im exokrinen Pankreas
Autor:Faust, Floriane
Weitere Beteiligte: Schrader, Michael (Dr.)
Veröffentlicht:2007
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2007/0713
DOI: https://doi.org/10.17192/z2007.0713
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2007-07137
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):Identification and characterisation of membrane proteins of zymogen granules: A participation of the small GTPase Rab8A in the formation of granules in the exocrine pancreas
Publikationsdatum:2007-10-29
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Exokrines Pankreas, Rab8A, Rab-Proteine, 2D-Elektrophorese, Proteomanalyse, Exocrine pancreas, Rab8A, Proteomanalyse, Granulabildung, Proteomics, Granule biogenesis, MALDI-MS, 2D-electrophoresis

Zusammenfassung:
Bei den polarisierten Azinuszellen des exokrinen Pankreas handelt es sich um auf die Synthese von Verdauungsenzymen, den Zymogenen, spezialisierte Zellen. Diese Zymogene werden in den Zymogengranula (ZG) gespeichert. Der Prozess der Granulabiogenese und Sekretion im exokrinen Pankreas ist noch weitestgehend ungeklärt. Pathophysiologische Veränderungen des Pankreas sind von klinischer Relevanz. Um Therapieansätze zur Behandlung zu entwickeln, müssen die molekularen Mechanismen der Granulabiogenese und Sekretion weiter aufgeklärt, sowie die molekularen „Mitspieler“ identifiziert werden. Zu diesen molekularen „Mitspielern“ zählen insbesondere Proteine der Zymogengranulamembran (ZGM). Bisher wurden jedoch nur wenige identifiziert. Ziel im ersten Teil der vorliegenden Arbeit war es, noch unbekannte Granulamembranproteine über Proteomics-Studien zu identifizieren und zu charakterisieren. Zur Identifizierung der Proteine der ZGM wurde erstmalig eine doppelte SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (dSDS-PAGE) etabliert, über die die ZGM-Proteine in einem Polyacrylamid-Gel angereichert und anschließend über MALDI-TOF-Massenspektrometrie (MS) analysiert wurden. In den 2D Gelen waren reproduzierbar 20-30 Proteinspots zu detektieren, die zum größten Teil direkt auf einer Diagonalen lokalisiert waren. Wenige Spots (3-4) lagen unterhalb der Diagonalen. Die Anordnung der Proteinspots wies auf das Vorhandensein von überwiegend wenig hydrophoben Proteinen im Gel hin. Die detektierten Spots lagen über einen Molekulargewichtsbereich von 10-120 kDa ungleichmäßig im Gel verteilt. Insbesondere im Molekulargewichtsbereich von 20-50 kDa wurde eine Anhäufung von Proteinspots sichtbar. Der Großteil (21 Spots) konnte über MALDI-TOF-MS und MALDI-TOF-TOF-MS über das „peptide mass fingerprinting“ unter Verwendung der Mascot Software analysiert und identifiziert werden. Bei 7 identifizierten Proteinen, handelte es sich um typische Membranproteine (Membrandipeptidase, GP2, Pancreatic Lipase related protein 2 precursor, ANT2, Cell surface antigen RB 13-6, Aminopeptidase M, VDAC1), deren Lokalisation zum Teil für die ZGM belegt ist. Die meisten dieser Membranproteine sind wenig hydrophob, da sie über einen GPI-Anker an die ZGM gebunden sind bzw. nur ein bis zwei Transmembrandomänen aufweisen. Auch bekannte, peripher an die ZGM assoziierte Proteine sowie ZG-Inhaltsproteine konnten identifiziert werden, sodass insgesamt 15 bekannte ZG-Proteine über dSDS-PAGE erfasst wurden. Aber auch bisher noch nicht an den ZG beschriebene Proteine (PPIC, ANT2, VDAC1/Porin) wurden identifiziert, deren Funktion an der ZGM unbekannt ist. Bei der dSDS-PAGE handelt es sich somit um eine reproduzierbare, zur Auftrennung von ZGM-Proteinen geeignete Methode, da sowohl neue als auch bereits bekannte ZGM- und ZGI-Proteine identifiziert werden konnten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde durch Antikörperscreening-Tests die kleine GTPase Rab8A an der Membran der ZG identifiziert. Die durchgeführten Untersuchungen belegen, dass Rab8A ein bisher unbekanntes, an der Membran der Zymogengranula lokalisiertes Rab-Protein ist. Im Immunoblot konnte Rab8A in aus dem Rattenpankreas isolierten ZG sowie in ZGM-Fraktionen detektiert werden. Morphologische Studien an AR42J Zellen belegen, dass Rab8A spezifisch an den ZG lokalisiert ist, da in der Immunfluoreszenz (IF) eine deutliche Kolokalisation von Rab8A und dem ZG-Markerprotein Carboxypeptidase A an den ZG sowie am Golgi-Komplex detektiert wurde. Um die mögliche Rolle von Rab8A bei der Granulabildung und/ oder Fusion zu ermitteln, wurden RNAi-Experimente durchgeführt, die die Expression von Rab8A in pankreatischen AR42J Zellen (zu 70-80 %) inhibierten. Morphologische Studien (IF und Elektronenmikroskopie) belegten, dass der Knock-down die ZG-Bildung in den Zellen inhibierte und gleichzeitig zu einer spezifischen Akkumulation von Granulamarkerproteinen im Golgi-Komplex führte, ohne die Morphologie des Golgi-Komplexes zu verändern. Dies äußerte sich in einer reduzierten, durch Stimulation ausgelösten Amylase- bzw. Gesamtsekretion der reguliert sekretorischen Proteine. Weitere durchgeführte Untersuchungen zeigten, dass der Golgi-abhängige Transport und die Sortierung anderer Markerproteine zu den Endosomen und zur Plasmamembran durch einen Rab8A Knock-down unbeeinflusst blieb. In der IF konnte keine Akkumulation von lysosomalen und Plasmamembran-Proteinen wie Endolyn 78, VSVG-SP-GFP und YFP-GL-GPI im Golgi-Komplex beobachtet werden. Auch für VSVG-SP-GFP und YFP-GL-GPI durchgeführte Oberflächenimmunpräzipitationen zeigten keine Veränderung des Transportes dieser Proteine an die Plasmamembran. Die Ergebnisse belegen somit, dass Rab8A ein Protein der ZGM ist, das eine Funktion in der frühen Phase der ZG-Bildung am Golgi-Komplex der Azinuszellen des exokrinen Pankreas wahrnimmt. Es ist das erste bekannte Protein, das eine essentielle Rolle bei der ZG-Bildung spielt.

Summary:
Polarized acinar cells of the exocrine pancreas are specialised in the synthesis of digestive enzymes (so called zymogens). The zymogens are stored in zymogen granules (ZG). The process of granule biogenesis in the exocrine pancreas is poorly understood. Of clinical relevance are the pathophysiological changes of the pancreas. The development of new therapy approaches requires the molecular mechanisms of the granule biogenesis and secretion as well as molecular players to be elucidated. Among the molecular players, the proteins of the zymogen granule membrane (ZGM) are of particular interest. So far only few proteins have been identified and characterised on a molecular and functional level. Therefore, it has been the aim of the first part of the present work to identify unknown ZGM proteins by proteomic studies and to characterize them. In order to identify proteins of the ZGM, a doubled SDS-polyacrylamide-gel-electrophoresis (dSDS-PAGE) was established for the first time, allowing an accumulation of ZGM proteins in a polyacrylamide-gel, which were finally analysed by MALDI-TOF mass spectrometry. In the two dimensional Coomassie-stained gels a total of 20-30 protein spots reproducible appeared. In most cases these spots were directly located on a diagonal and only a few spots (normally 3-4) were localized below this diagonal. The dispersal of the protein spots suggested that the proteins of the gel are mainly moderately hydrophobic. The detected protein spots in the gel were distributed irregularly around molecular weight levels of 10-120 kDa. Particularly at the molecular weight level of 20-50 kDa an aggregation of protein spots became visible. The majority (21 spots) was analysed and identified by MALDI-TOF-MS and MALDI-TOF-TOF-MS “peptide mass fingerprinting” using Mascot Software (Matrix Science Ltd.). The identification of the proteins by mass spectrometry revealed that seven proteins were membrane proteins (membranedipeptidase, GP2, pancreatic lipase related protein 2 precursor, ANT2, cell surface antigen RB 13-6, aminopeptidase M, VDAC1) and that some of them were already known ZGM proteins. The majority of these membrane proteins are moderately hydrophobic. This is due to the fact that they are integrated in the ZGM either by a GPI-anchor or by one or two transmembrane domains. Moreover, already known peripheral ZG proteins as well as proteins of the granule content could be identified with the result that a total of 15 already known ZG proteins were detected by dSDS-PAGE. However, hitherto unknown proteins of the ZGM, whose function at the zymogen granule membrane is yet unknown (PPIC, ANT2, VDAC1/porin) were also identified. All in all the results generated by dSDS-PAGE and MALDI-TOF-analysis demonstrate that the dSDS-PAGE is a useful and reproducible method for the separation of ZGM proteins, because both new and already known ZGM as well as ZG content proteins could be detected. In the second part of this thesis the small GTPase Rab8A was identified by antibody screening tests on the ZGM. The studies prove that Rab8A is a new and yet unknown Rab-protein of the ZGM. By immunoblotting Rab8A was detected in isolated ZG fractions of the rat pancreas as well as in ZGM fractions, which were obtained by granule subfractionation. Morphological studies on AR42J cells proved that Rab8A localizes specifically to ZG and to the Golgi complex, because a clearly colocalisation with the ZG marker protein Carboxypeptidase A became visible by immunofluorescence. To determine the putative role of Rab8A in granule formation and/ or granule fusion, we conducted RNA interference experiments to inhibit the expression of Rab8A (to 70-80 %) in pancreatic AR42J cells. Morphological studies (immunofluorescence and electron microscopy) revealed that the silencing of Rab8 resulted in a significant decrease in the number of ZG and in an accumulation of granule marker proteins within the Golgi-complex without affecting the morphology of the Golgi-complex. This was expressed in a reduced amylase secretion after stimulation as well as in a decreased overall secretion of regulated secretory proteins in the cells. Further studies demonstrated that the Golgi-dependent trafficking and sorting of other marker proteins to the endosomal compartment and to the plasma membrane was not affected by the silencing of Rab8A. An accumulation of lysosomal and plasma membrane proteins like Endolyn-78, VSG-SP-GFP and YFP-GL-GPI could not be detected by immunofluorescence. Moreover, a cell-surface immunoprecipitation conducted for VSVG-SP-GFP and YFP-GL-GPI revealed no changes of the protein transport to the plasma membrane. The data provide first evidence that Rab8A is a protein of the ZGM, that plays a role in the early phase of ZG formation at the Golgi-complex of the acinar cells of the exocrine pancreas. It is the first protein identified so far that plays an essential role in the biogenesis of zymogen granules.


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