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Zusammenfassung:
Bei den polarisierten Azinuszellen des exokrinen Pankreas handelt es sich um auf die Synthese von Verdauungsenzymen, den Zymogenen, spezialisierte Zellen. Diese Zymogene werden in den Zymogengranula (ZG) gespeichert. Der Prozess der Granulabiogenese und Sekretion im exokrinen Pankreas ist noch weitestgehend ungeklärt. Pathophysiologische Veränderungen des Pankreas sind von klinischer Relevanz. Um Therapieansätze zur Behandlung zu entwickeln, müssen die molekularen Mechanismen der Granulabiogenese und Sekretion weiter aufgeklärt, sowie die molekularen „Mitspieler“ identifiziert werden. Zu diesen molekularen „Mitspielern“ zählen insbesondere Proteine der Zymogengranulamembran (ZGM). Bisher wurden jedoch nur wenige identifiziert. Ziel im ersten Teil der vorliegenden Arbeit war es, noch unbekannte Granulamembranproteine über Proteomics-Studien zu identifizieren und zu charakterisieren. Zur Identifizierung der Proteine der ZGM wurde erstmalig eine doppelte SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (dSDS-PAGE) etabliert, über die die ZGM-Proteine in einem Polyacrylamid-Gel angereichert und anschließend über MALDI-TOF-Massenspektrometrie (MS) analysiert wurden. In den 2D Gelen waren reproduzierbar 20-30 Proteinspots zu detektieren, die zum größten Teil direkt auf einer Diagonalen lokalisiert waren. Wenige Spots (3-4) lagen unterhalb der Diagonalen. Die Anordnung der Proteinspots wies auf das Vorhandensein von überwiegend wenig hydrophoben Proteinen im Gel hin. Die detektierten Spots lagen über einen Molekulargewichtsbereich von 10-120 kDa ungleichmäßig im Gel verteilt. Insbesondere im Molekulargewichtsbereich von 20-50 kDa wurde eine Anhäufung von Proteinspots sichtbar. Der Großteil (21 Spots) konnte über MALDI-TOF-MS und MALDI-TOF-TOF-MS über das „peptide mass fingerprinting“ unter Verwendung der Mascot Software analysiert und identifiziert werden. Bei 7 identifizierten Proteinen, handelte es sich um typische Membranproteine (Membrandipeptidase, GP2, Pancreatic Lipase related protein 2 precursor, ANT2, Cell surface antigen RB 13-6, Aminopeptidase M, VDAC1), deren Lokalisation zum Teil für die ZGM belegt ist. Die meisten dieser Membranproteine sind wenig hydrophob, da sie über einen GPI-Anker an die ZGM gebunden sind bzw. nur ein bis zwei Transmembrandomänen aufweisen. Auch bekannte, peripher an die ZGM assoziierte Proteine sowie ZG-Inhaltsproteine konnten identifiziert werden, sodass insgesamt 15 bekannte ZG-Proteine über dSDS-PAGE erfasst wurden. Aber auch bisher noch nicht an den ZG beschriebene Proteine (PPIC, ANT2, VDAC1/Porin) wurden identifiziert, deren Funktion an der ZGM unbekannt ist. Bei der dSDS-PAGE handelt es sich somit um eine reproduzierbare, zur Auftrennung von ZGM-Proteinen geeignete Methode, da sowohl neue als auch bereits bekannte ZGM- und ZGI-Proteine identifiziert werden konnten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde durch Antikörperscreening-Tests die kleine GTPase Rab8A an der Membran der ZG identifiziert. Die durchgeführten Untersuchungen belegen, dass Rab8A ein bisher unbekanntes, an der Membran der Zymogengranula lokalisiertes Rab-Protein ist. Im Immunoblot konnte Rab8A in aus dem Rattenpankreas isolierten ZG sowie in ZGM-Fraktionen detektiert werden. Morphologische Studien an AR42J Zellen belegen, dass Rab8A spezifisch an den ZG lokalisiert ist, da in der Immunfluoreszenz (IF) eine deutliche Kolokalisation von Rab8A und dem ZG-Markerprotein Carboxypeptidase A an den ZG sowie am Golgi-Komplex detektiert wurde. Um die mögliche Rolle von Rab8A bei der Granulabildung und/ oder Fusion zu ermitteln, wurden RNAi-Experimente durchgeführt, die die Expression von Rab8A in pankreatischen AR42J Zellen (zu 70-80 %) inhibierten. Morphologische Studien (IF und Elektronenmikroskopie) belegten, dass der Knock-down die ZG-Bildung in den Zellen inhibierte und gleichzeitig zu einer spezifischen Akkumulation von Granulamarkerproteinen im Golgi-Komplex führte, ohne die Morphologie des Golgi-Komplexes zu verändern. Dies äußerte sich in einer reduzierten, durch Stimulation ausgelösten Amylase- bzw. Gesamtsekretion der reguliert sekretorischen Proteine. Weitere durchgeführte Untersuchungen zeigten, dass der Golgi-abhängige Transport und die Sortierung anderer Markerproteine zu den Endosomen und zur Plasmamembran durch einen Rab8A Knock-down unbeeinflusst blieb. In der IF konnte keine Akkumulation von lysosomalen und Plasmamembran-Proteinen wie Endolyn 78, VSVG-SP-GFP und YFP-GL-GPI im Golgi-Komplex beobachtet werden. Auch für VSVG-SP-GFP und YFP-GL-GPI durchgeführte Oberflächenimmunpräzipitationen zeigten keine Veränderung des Transportes dieser Proteine an die Plasmamembran. Die Ergebnisse belegen somit, dass Rab8A ein Protein der ZGM ist, das eine Funktion in der frühen Phase der ZG-Bildung am Golgi-Komplex der Azinuszellen des exokrinen Pankreas wahrnimmt. Es ist das erste bekannte Protein, das eine essentielle Rolle bei der ZG-Bildung spielt.

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