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Zusammenfassung:
Naturstoffe mit einem außerordentlich breiten Spektrum an Strukturen und pharmakologischen Bedeutungen werden fließbandartig an multimodular aufgebauten nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) assembliert. Jedes Modul dieser Megaenzyme umfasst dabei eine Anzahl von katalytisch eigenständigen Domänen, deren spezifische Interaktion den Einbau und die Modifikation eines Bausteins sichert. Sehr häufig enthalten die Produkte D-Aminosäuren, die zum Großteil durch modulintegrierte Epimerisierungs- (E-) Domänen aus den entsprechenden über einen Thioester peptidyl carrier protein (PCP) gebundenen L-Intermediaten in einer Gleichgewichtsreaktion erzeugt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein chemoenzymatischer Ansatz zur quantitativen Untersuchung der nativen Substratspezifität von vier unterschiedlichen Synthetasen entstam-menden E-Domänen entwickelt. Dazu wurden entsprechende PCP-E-Didomänen auf geneti-scher Ebene isoliert. Zwei dieser Konstrukte (TycB3- und FenD2-PCP-E) enstammten Elongationsmodulen und enthielten sogenannte Peptidyl-E-Domänen, während die beiden anderen (TycA- und GrsA-PCP-E) Initiationsmodulen entnommen wurden und entsprechend Aminoacyl-E-Domänen trugen. Die Apo-Proteine wurden überproduziert und unter Verwen-dung der promiskuitiven 4´-Phophopantethein- (Ppant-) Transferase Sfp mit einer Auswahl synthetisierter Peptidyl-CoAs fehlmodifiziert. Enzymgebundene Peptidyl-S-Ppant Reaktions-produkte der darauffolgenden, durch die E-Domänen katalysierten Stereoinversion wurden chemisch abgespalten und auf ihr L zu D-Verhältnis untersucht. Wie anhand von jeweils berechneten kobs-Werten und vorgefundenen L/D-Endgleichgewichten evaluiert wurde, tolerieren alle vier getesteten E-Domänen eine Vielfalt von Peptidyl-S-Ppant-Substraten. Es zeigte sich, dass kein Zusammenhang zwischen der Spezifität (aktivierter Aminosäure) eines Moduls und der Toleranz der ihm entstammenden E-Domäne existiert. Veränderungen am N-terminalen Ende des Substrats können dabei gleiche Auswirkungen auf die Epimerisierungs-aktivität haben wie Variationen des C-Terminus (der Thioester gebundenen Aminosäure). Die E-Domänen invertierten N-methylierte Substrate besonders effizient. Hervorzuheben ist die entdeckte Fähigkeit von Aminoacyl-E-Domänen zur Epimerisierung von Peptidyl-Substraten. Außerdem konnte deutlich gemacht werden, dass die Kondensations (C-) Domäne von TycB1 ebenso in der Lage ist, Peptidyl-Substrate von TycA zu empfangen und zu prozessieren. Da E-Domänen in vielen Systemen am C-Terminus einer Synthetase stehen, wurde angenommen, dass sie in dieser Position an der gezielten Interaktion mit dem nachfolgenden Enzym und dem geregelten Transfer von Intermediaten beteiligt sind. Deshalb setzte sich der zweite Teil der vorliegenden Arbeit mit der Beleuchtung dieser funktionellen Rolle auseinander. Es wurden dimodulare Derivate aus der Tyrocidin-Synthetase B auf genetischer Ebene konstruiert und die überproduzierten rekombinanten Proteine charakterisiert. Zunächst wurde eine optimierte Abfolge aus tryptischer Proteolyse und hochauflösender Massenspek-trometrie eingesetzt, um die Bildung von Intermediaten am TycB3-PCP des TycB2-3-Wildtyps und des E-Domänen-Austauschproteins TycB2-3-AT.CAT/EtycA direkt zu verfolgen. Der E-Domänen-Austausch beeinträchtigte die Dipeptid- (Phe-Phe-) Bildung signifikant. Ferner wurden die beiden genannten Enzyme und ein weiteres, bei dem die Kommunikation vermittelnde (COM-) Domäne gegen die entsprechende von TycA ausgetauscht worden war, mit dem Akzeptor TycB1 getestet. Funktionelle Unterschiede zwischen Peptidyl- und Aminoacyl-E-Domänen im Kontext der in trans Interaktion wurden hierbei deutlich. Peptidyl-E-Domänen scheinen für die Regulation von Kondensation, Epimerisierung und Transfer von Zwischenstufen zum downstream Modul optimiert zu sein, während Aminoacyl-E-Domänen die upstream Kondensation beeinträchtigen und Misinitiation hervorrufen. Diese Erkenntnisse werden für die erfolgreiche Gestaltung neuer Wirkstoffe per Biokombinatorik mit NRPS unter Einbeziehung von E-Domänen von Bedeutung sein.

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