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Titel:Depletion des Myc-interagierenden Zinkfingerproteins 1 mittels RNA Interferenz und Die Rolle von Miz-1 in der zellulären DNA Schadensantwort auf UV-Licht
Autor:Rogosch, Dorothee
Weitere Beteiligte: Eilers, Martin (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2006
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2006/0290
DOI: https://doi.org/10.17192/z2006.0290
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2006-02903
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):Knock out of the Myc-interacting zinc-finger protein 1 by RNA interference and the role of Miz-1 in the cellular DNA damage response upon UV irradiation
Publikationsdatum:2006-05-03
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Carcinogenese, RNA-interference, Miz-1, Knockout <Molekulargenetik>, Myc, TopBP1, Onkogen, UV-Schaden, p21, RNS-Interferenz, Tumorsuppressor-Gen, TopBP1, Myc, Zellzyklus-Checkpoint, DNA-damage-checkpoint, Miz-1, Protein p53

Zusammenfassung:
Die vorliegende Dissertationsarbeit beschäftigte sich zum einen methodisch mit dem Gen-Knock-out des mit Myc interagierenden Proteins Miz-1 mittels der kürzlich erschlossenen Technik der RNA Interferenz in Säugerzellen. Zum anderen wurde unter Nutzung der RNA Interferenz ein Zusammenhang aus dem Bereich zellulärer Schadenskontrollmechanismen, speziell der Regulation der UV-induzierten DNA-Schadensantwort durch das Myc interagierende Protein Miz-1 geklärt. Der erste Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Nutzung eines evolutionär konservierten Abwehrmechanismus der Zelle gegen Fremdgene, der RNA Interferenz. Der Knock-out mittels RNA Interferenz ersetzt zunehmend die konventionellen Gen-Knock-out-Technologien. Durch RNA Interferenz Versuche mit Kotransfektion eines Glühwürmchen-Luziferase-kodierenden Plasmids und eines sequenz-homologen RNA-Doppelstrangs konnte ein deutlicher Rückgang der Plasmid-induzierten Lumineszenz gegenüber den allein mit Reporter-Plasmid transfizierten oder mit Nonsense-RNA kotransfizierten Zellen erreicht werden. Mittels dieses spezifischen Knock-out eines Gens wurde die Eignung der Säugerzelllinien HaCaT, einer humanen Keratinozyten-Zelllinie, HeLa, ebenfalls humaner Zervix-Karzinom-Zellen und MEF, primärer muriner Embryo-Fibroblasten zur RNA Interferenz dargelegt. Anschließend wurde die Depletion des Transkriptionsfaktors Miz-1 durchgeführt. Ähnlich wie in zahlreichen bisherigen RNA Interferenz-Versuchen in Säugerzellen konnte nur ein partieller Knock-out des Gens erreicht werden. Aber auch eine partielle Depletion eines Gens hat Auswirkungen auf den resultierenden Phänotyp. Die Möglichkeit eines partiellen Miz-1 Knock-out, auch als Knock-down bezeichnet, eröffnet umfangreiche Möglichkeiten der Funktionsanalyse des Gens und seiner Interaktionspartner sowie der Analyse Miz-1-abhängiger Signaltransduktionswege. Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der zellulären Antwort auf UV-induzierte DNA-Schäden. Dabei wurde ein vom Tumorsuppressor p53 abhängiger sowie ein p53-unabhängiger Schadens-Kontrollpunkt untersucht und die jeweilige Bedeutung des Transkriptionsfaktors Miz-1 geprüft. Zur Analyse der p53-abhängigen zellulären Antwort auf UV-induzierte DNA-Schäden wurden ARF / Maus-Embryo-Fibroblasten verwandt, da Myc in UV bestrahlten Wildtyp-MEF-Zellen eigenständig über ARF Apoptose induziert. Durch p53 werden eine Reihe von Genen, unter anderem der CdK-Inhibitor p21cip1, aktiviert, die Zellzyklusarrest oder Apoptose einleiten. Wie die vorliegenden Untersuchungen zeigen, ist für die p21cip1-Expression in der UV-Antwort neben dem Tumorsuppressor p53 die Anwesenheit des Transkriptionsfaktors Miz-1 notwendig. Nach Depletion des Myc interagierenden Proteins mittels RNA Interferenz liegt eine gehemmte Expression des CdK-Inhibitors p21cip1 vor. Mit der Depletion von Miz-1 durch RNA Interferenz vergleichbar ist der funktionelle Ausfall der Aktivität von Miz-1 in Zellen mit deregulierter Expression von Myc. In MEF-Zellen verhindert eine Überexpression des Onkogens die UV-induzierte Aktivierung der Expression von p21cip1. Folge ist die verkürzte Dauer des Zellzyklusarrestes und ein rascher Wiedereintritt der geschädigten Zelle in den Zellzyklus. Anzunehmen ist also, dass die negative Regulation der DNA-Schadensantwort auf UV-Licht durch Myc in Miz-1 abhängiger Weise erfolgt. Anhand eines Zellsystems p53-defizienter humaner Keratinozyten konnte die p53-unabhängige Schadensantwort auf verschiedene DNA-schädigende Agenzien untersucht werden. Ein für HaCaT-Zellen ermittelter Signaltransduktionsweg nach DNA-Schädigung wurde zunächst reproduziert. Die UV-Bestrahlung der Keratinozyten löst eine transiente Repression des Topoisomerase-bindenden Proteins TopBP1 aus. Das aus dem inhibitorischen Komplex mit TopBP1 frei werdende Miz-1 veranlasst die transkriptionelle Aktivierung des CdK-Inhibitors p15INK4B. Ähnlich der Induktion der p21cip1-Expression ist das Resultat des UV-Schadens die Aktivierung eines CdK-Inhibitors mit folgendem Zellzyklusarrest. Die Zytostatika Zeozin und Hydroxy-Harnstoff zeigten keinen Einfluss auf die Expression von Myc, Miz, TopBP1 oder p15INK4B, den beteiligten Interaktionspartnern des Schadens-Kontrollpunktes der UV-Antwort der Keratinozyten-Zelle. Die Ergebnisse sprechen für die Schadens-Spezifität der p53-unabhängigen UV-Antwort. Der untersuchte Signaltransduktionsweg ist an der zellulären Antwort auf die Zytostatika-induzierten DNA-Defekte nicht beteiligt. Es ist möglich, dass der Miz 1/TopBP1-Komplex Bestandteil eines ausschließlich durch UV-Licht ausgelösten Schadens-Kontrollpunktes ist.

Summary:
On the one hand, this thesis deals with the gene knock-out of the Myc interacting protein Miz 1 by means of the technique of RNA interference in mammalian cells. On the other hand, an aspect of cellular damage control mechanisms, especially the regulation of UV irradiation induced DNA damage response by the Myc interacting protein Miz-1 was clarified by the use of RNA interference. The first part deals with an evolutionarily conserved cellular defence mechanism against foreign genes, the RNA interference. Knock-out by RNA interference replaces increasingly the conventional gene knock-out technologies. A significant decrease of plasmid induced luminescence was achieved by cotransfaction of a plasmid coding for firefly luciferase and a sequence homologous double stranded RNA. The suitability of the mammalian cell lines HaCaT, a humane keratinocyte cell line, HeLa, humane cervix carcinoma cells and MEF, murine embryo fibroblasts, for RNA interference was shown by that specific gene knock out. The posttranscriptional gene silencing of the transcription factor Miz-1 was realized. Like in previous RNA interference experiments in mammalian cells only a partial knock-out of the target-gene could be achieved. But also a partial knock-out of a gene has effects on the resulting phenotype. The possibility of a partial Miz-1 knock-out opens up extensive possibilities for the functional analysis of the gene and its interaction partners as well as the analysis of signal transduction pathways that are dependent on Miz-1. The second part deals with the cellular response to UV induced DNA damages. Therefore a DNA damage checkpoint that is dependent on p53 as well as a p53 independent one was investigated and the role of Miz-1 was examined. For the analysis of the p53 dependent cellular response to UV irradiation induced DNA damages ARF-/--mouse embryo fibroblasts were used. In wild-type mouse embryo fibroblasts, Myc alone can induce apoptosis through ARF. By p53 numerous genes which cause cell cycle arrest or apoptosis are activated, e.g. the CdK inhibitor p21cip1. Beside p53 the transcription factor Miz-1 is essential for the expression of p21cip1 after UV irradiation. We could show that treatment of cells with siRNA directed against Miz-1 attenuated the expression of p21cip1 in UV-irradiated cells. An overexpression of the onkogen Myc prevents an activation of the expression of p21cip1 after UV-irradiation in MEF cells. Consequently an abbreviated duration of cell cycle arrest and an early re-entry of the damaged cell into cell cycle occurs. In response to UV irradiation, Myc inhibits UV-induced cell cycle arrest by p53 through Miz-1. The p53 independent damage response to different DNA damaging agents could be examined in HaCaT cells lack functional p53 and therefore do not induce p21Cip1. UV irradiation downregulates expression of TopBP1 and releases Miz-1 from an inhibitory complex with TopBP1 and causes transcriptional activation of p15INK4B. Expression analyses by RT-PCR show that DNA damages caused by cytostatic drugs like Zeozin and Hydroxyurea have no influence on the expression of Myc, Miz-1, TopBP1 and p15INK4B. These results plead for the damage specificity of the p53 independent UV-response. No involvement of the examined Miz1 dependent signal transduction pathway could be shown in the cellular response to cytostatic drug induced DNA defects. Our data support the hypothesis that the Miz-1/TopBP1 complex is part of a checkpoint exclusively triggered by UV induced DNA damage.


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