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Zusammenfassung:
Tetrahydrofolat (H4F) spielt als Überträger von C1-Einheiten im Baustoffwechsel von allen Bacteria und Eucarya und von einigen Archaea eine wichtige Rolle in der Synthese von C1-Einheiten enthaltenden Verbindungen wie Purine, Thymidin und Methionin. Im Baustoffwechsel von methanogenen Archaea, die alle kein H4F enthalten sollen, wird H4F durch Tetrahydromethanopterin (H4MPT) ersetzt, das ein strukturelles Analogon von H4F ist, und das als C1-Überträger essentiell an der Methanbildung aus CO2 oder Acetat beteiligt ist. Nur im Baustoffwechsel von Archaea der Ordnung Methanosarcinales scheint H4MPT nicht an der Synthese von Purinen, Thymidin und Methionin beteiligt zu sein, was aus 13C-Markierungsexperimenten hervorgeht und die Frage aufwirft, ob diese Organismen neben H4MPT nicht doch noch zusätzlich H4F besitzen. Diese Frage zu beantworten, war das Ziel der vorliegenden Arbeit. Die Versuche wurden mit dem Organismus Methanosarcina barkeri durchgeführt, der Tetrahydrosarcinapterin (H4SPT) an Stelle von H4MPT enthält. H4SPT wird aus H4MPT durch Anfügen eines Glutamatrestes synthetisiert, der ohne Einfluss auf die Aktivität von diesem Coenzym ist. Im Genom von Methanosarcina barkeri, M. acetivorans, M. thermophila und M. mazei wurden Gene gefunden, die für folgende H4F-spezifische Enzyme kodieren könnten: Serin-Hydroxymethyltransferase (GlyA), Methylen-H4F-Dehydrogenase/Methenyl-H4F-Cyclohydrolase (FolD), Methylen-H4F-Reduktase (MetF), Phosphoribosylglycinamid-Formyltransferase (PurN) und Phosphoribosylaminoimidazolcarboxamid-Formyltransferase (PurH). Diese Gene wurden mit Ausnahme von glyA in den Genomen von Methanothermobacter thermoautotrophicus, Methanococcus jannaschii, Methanococcus maripaludis und Methanopyrus kandleri nicht gefunden. Es gelang, zwei dieser Gene aus M. barkeri, folD und glyA, heterolog in E. coli ohne Bildung von „Inclusion Bodies“ zu exprimieren. Die rekombinanten aktiven Enzyme wurden charakterisiert und polyklonale Antikörper zum Nachweis der Proteine in M. barkeri produziert. Das Gen folD kodierte für eine bifunktionelle Methylen-H4F-Dehydrogenase/Methenyl-H4F-Cyclohydrolase, die sowohl die Oxidation von Methylen-H4F mit NAD+ zu Methenyl-H4F+ und NADH als auch die Hydrolyse von Methenyl-H4F+ zu N10-Formyl-H4F katalysiert. Beide Aktivitäten waren strikt H4F-spezifisch. Das Gen glyA kodierte für Serin-Hydroxymethyltransferase, die in Gegenwart von H4F die Spaltung von L-Serin zu Glycin unter Bildung von Methylen-H4F katalysierte. H4F war in der Reaktion durch H4MPT ersetzbar, wobei die Aktivität allerdings weniger als 1% gegenüber der Aktivität mit H4F betrug. Die apparenten Km-Werte für Methylen-H4F (FolD) und (6S)-H4F (GlyA) lagen unter 5 µM. Die Genprodukte von folD und glyA konnten in Zellextrakten von M. barkeri mittels Western-Blot-Analysen und Aktivitätsmessungen nachgewiesen werden. Ein Hinweis für das Vorkommen von H4F in M. barkeri wurde indirekt durch Wachstumsversuche erhalten: Es wurde gefunden, dass das Wachstum des Archaeons von Folsäure (200 nM) oder p-Aminobenzoesäure (20 nM) im Medium abhängig ist und durch Sulfanilamid (2 mM) gehemmt wird. Unter p-Aminobenzoesäure-limitierenden Wachstumsbedingungen waren ca. 2 nmol p-Aminobenzoesäure für die Bildung von 1 g Zellen (Feuchtmasse) nötig, woraus sich eine intrazelluläre H4F-Konzentration von 5 µM abschätzen ließ unter der Annahme, dass p-Aminobenzoesäure ausschließlich für die Biosynthese von H4F verwendet wurde. Die intrazelluläre H4SPT-Konzentration von M. barkeri wurde zu 3 mM bestimmt und es wurde gefunden, dass sie unabhängig von der p-Aminobenzoesäure-Konzentration im Wachstumsmedium war. Die Daten deuten darauf hin, dass M. barkeri bei Wachstum unter p-Aminobenzoesäure-limitierenden Bedingungen freie p-Aminobenzoesäure nicht für die H4SPT-Synthese verwenden kann, was bestehender Literatur widerspricht. Dies wurde unabhängig durch Versuche bestätigt, bei denen die Aufnahme von [Carboxyl-14C]-p-Aminobenzoesäure in die Zellen verfolgt wurde. Unter den experimentellen Bedingungen wurden maximal 0,4% des H4SPT aus der vom Medium aufgenommenen p-Aminobenzoesäure synthetisiert, was über den Radioaktivitätsverlust durch Decarboxylierung während des Einbaus von p-Aminobenzoesäure in H4SPT ermittelt wurde. Darüber hinaus wurden Versuche zur Substratspezifität der Serin-Hydroxymethyltransferase von Methanococcus jannaschii durchgeführt, die zeigten, dass dieses Enzym H4MPT-spezifisch ist. Die Publikation zu diesen Ergebnissen befindet sich im Anhang.

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