Zusammenfassung:
In der filamentösen Braunalge Ectocarpus
siliculosus liegen die Enzyme Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase
(PEPCK) und das NADP+-Malat-Enzym in hohen Aktivitäten vor. Die
Beteiligung beider Enzyme an einem für die Alge vorgeschlagenen
C4/CAM-Metabolismus wurde fraglich, nachdem zum einen nicht
alle der für einen vollständigen Zyklus benötigten Enzyme
nachgewiesen werden konnten und zum anderen mögliche Metabolite
in vivo in zu geringen Konzentrationen vorlagen, um für den
postulierten Speichermetaboliten von CO2 in Frage zu kommen.
Daraus ergab sich die Frage nach der zellulären Funktion der
Enzyme. Zur Klärung der Funktion sowohl der PEPCK als auch des
NADP+-Malat-Enzyms wurden die Enzyme aus E. siliculosus
isoliert und gereinigt. Dabei wurde für die native PEPCK eine
relative molekulare Masse von 90 kDa ermittelt. Nach
Denaturierung in der SDS-PAGE zeigte sich ein 62 kDa- sowie ein
prominenteres 18 kDa-Polypeptid. Die relative molekulare Masse
des nativen NADP+-Malat-Enzyms wurde mit 440 kDa bestimmt. In
der SDS-PAGE zeigte sich ein einzelnes 56 kDa-Polypeptid, und
es wurde geschlossen, dass das funktionelle Enzym als Oktamer
vorliegt. Für alle der für die Carboxylierungsreaktion der
PEPCK benötigten Substrate ergaben sich normale
Michaelis-Menten-Kinetiken mit den Km-Werten 1,46 mM (CO2), 0,5
mM (PEP) und 0,23 mM (ADP). Auch für die
Decarboxylierungsreaktion des Malat-Enzyms zeigte sich mit
Malat eine normale Michaelis-Menten-Kinetik (Km = 0,36 mM). Im
Fall des NADP+ wurde das Vorliegen positiver Kooperativität mit
einem Hill-Koeffizienten von 2,74 nachgewiesen. Dies deutet
darauf hin, daß das Enzym über mindestens drei Bindungsstellen
für NADP+ verfügt. Zur Herstellung spezifischer Antikörper
gegen beide Enzyme wurden Kaninchen mit den denaturierten
Polypeptiden nach der SDS-PAGE immunisiert. Trotz wiederholtem
Ansatz und verlängertem Standardimmunisierungsprogramm ergab
sich ein geeignetes Antiserum nur für das 18 kDa-Polypeptid der
PEPCK. Die IgG-Fraktion dieses Serums reagierte sowohl mit dem
18 kDa- als auch mit dem 62 kDa-Polypeptid der PEPCK, was
darauf hindeutet, dass beide Polypeptide Degradationsprodukte
eines wahrscheinlich monomeren nativen Polypeptids sind. In
Immunlokalisationsstudien mit diesem Antikörper wurde die PEPCK
in den Pyrenoiden von E. siliculosus nachgewiesen. Ebenso
befindet sich die Rubisco, nachgewiesen mit einem Antikörper
gegen das native Enzym aus Spinat, in den Pyrenoiden. Die
Lokalisation der PEPCK in direkter Nachbarschaft zur Rubisco
schließt erneut die Funktion eines C4-Mechanismus bei E.
siliculosus aus. Eine anaplerotische Rolle der PEPCK in den
Zellen der Alge ist wahrscheinlich.