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Titel:Struktur und räumliche Verteilung mikrobieller Gemeinschaften im Verdauungstrakt ausgewählter Boden-Invertebraten
Autor:Egert, Markus
Weitere Beteiligte: Friedrich, Michael W. (Priv.-Doz. Dr.)
Erscheinungsjahr:2004
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0064
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2004-00643
DOI: https://doi.org/10.17192/z2004.0064
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.):Structure and topology of microbial communities in the intestinal tract of selected soil invertebrates

Dokument

Schlagwörter:
microbial ecology, beetle larvae, Verdauung, Regenwurm, gut, Topologie, Archaea, Scarabaeidae, Maikäfer, Ökologie, Rosenkäfer, Darm, Mikrobielle Ökologie, Bacteria, earthworm, 16S rRNA-Gen, Prokaryonten, digestion

Zusammenfassung:
Boden-Makroinvertebraten sind entscheidend an der Transformation organischer Substanz beteiligt, die für viele Schlüsselfunktionen des Bodens verantwortlich ist. An den Transformationsprozessen, die während der Darmpassage ingestierter organischer Substanz ablaufen, sind intestinale Mikroorganismen beteiligt, die auch für die Ernährung ihrer Wirte von entscheidender Bedeutung sind. Über die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaften im Verdauungstrakt der meisten Boden-Invertebraten sowie ihre räumliche Verteilung innerhalb verschiedener Darmabschnitte ist allerdings nur wenig bekannt. Gerade die Topologie mikrobieller Gemeinschaften wird aber als eine wichtige Voraussetzung zum tieferen Verständnis ihrer Funktion in Verdauungstrakten von Invertebraten angesehen, die von ausgeprägten axialen und radialen Gradienten physiko-chemischer Parameter geprägt sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher Struktur und räumliche Verteilung mikrobieller Gemeinschaften im Verdauungstrakt der Larven zweier Scarabaeiden (Pachnoda ephippiata [Kongo-Rosenkäfer] und Melolontha melolontha [Feldmaikäfer]) und von Regenwürmern (Lumbricus terrestris) mit Methoden der molekularen mikrobiellen Ökologie untersucht. Während der Untersuchungen wurde zudem ein neuartiger PCR-Artefakt, die Bildung sog. pseudo-T-RFs, mit bedeutenden Auswirkungen für die T-RFLP-Analyse mikrobieller Gemeinschaften entdeckt, beschrieben und mögliche Ansätze zu seiner Vermeidung aufgezeigt. In einer T-RFLP-Studie mit Regenwürmern wurde gezeigt, dass sich die Darmmikrobiota dieser Tiere aus der Nahrung rekrutiert, d.h. ihnen im Gegensatz zu vielen anderen Boden-Invertebraten eine spezifische Darmflora fehlt. Es wurde deutlich, dass die mit dem gefressenen Boden aufgenommene mikrobielle Gemeinschaft während der Darmpassage signifikante Veränderungen ihrer relativen Zusammensetzung erfährt und dass die Unterschiede zwischen den mikrobiellen Gemeinschaften von Futter, Darm und Losung stark von der Diät der Regenwürmer beeinflusst werden. Die hier präsentierten Ergebnisse zur Intestinalmikrobiologie von Scarabaeidenlarven stellen die ersten ihrer Art für Käferlarven und mit die ersten für andere Boden-Arthropoden als Termiten dar. Es konnte gezeigt werden, dass sich die ausgeprägten Unterschiede physiko-chemischer Parameter (pH-Wert, Redoxpotential, Fettsäurespektren), die zwischen den Haupt-Darmabschnitten (Mittel- und Enddarm) der Larven herrschen, in einer deutlich unter-schiedlichen Besiedlung mit Mikroorganismen widerspiegeln. Im Gegensatz zu den untersuchten Regenwürmern ist die Darmmikrobiota der Scarabaeidenlarven als spezifische Darmflora anzusehen, da sie deutlich verschieden zur Mikrobiota der aufgenommenen Nahrung war. Bei beiden Larven war der Mitteldarmabschnitt weniger dicht besiedelt als der als Gärkammer angesehene Enddarm. Die Methanogenese war stets auf den Enddarm beschränkt; bei den Maikäferlarven wurden Methanobrevibacter-Arten, bei den Rosenkäferlarven zusätzlich Methanomicrococcus-Arten als verantwortliche Methanogene identifiziert. Im Vergleich zu den Bacteria war aber sowohl die Diversität als auch die relative Häufigkeit der Archaea sehr gering. Die phylogenetische Analyse der Bakteriengemeinschaften zeigte eine sehr große Diversität auf, die offensichtlich viele bislang unkultivierte Arten umfasst. Die überwiegende Mehrheit aller Sequenzen ließ sich den Actinobacteria, Bacillales, Bacteroidetes, Clostridiales, Lactobacillales und Proteobacteria zuordnen; viele Klone gruppierten mit Klonen und Isolaten aus anderen Intestinalsystemen, ein weiterer Beleg für die Darmspezifität der Scarabaeiden-Mikrobiota. Die Verwandtschaft vieler Klone zu hydrolytischen, cellulolytischen und gärenden Isolaten stand in Einklang mit den Fettsäureprofilen der Darmabschnitte (v.a. Acetat und Lactat) und deutet die Beteiligung von Mikroorganismen an der Transformation organischer Substanz nach dem Modell einer anaeroben Nahrungskette zumindest im Enddarm an. Ob dies auch für den Mitteldarmabschnitt gilt, ist noch unklar, da bei den Maikäferlarven keine stabile Darmmikrobiota in diesem Kompartiment nachgewiesen werden konnte. Am Enddarm der Maikäferlarven wurde erstmals für Arthropoden eine umfassende Analyse der mikrobiellen Gemeinschaften in den Unterfraktionen Wand und Lumen eines Darmabschnittes durchgeführt. Hierbei wurden ausgeprägte Unterschiede in der Besiedlung dieser beiden Fraktionen festgestellt, die als Anpassungen an morphologische (Chitinbäumchen an der Enddarmwand) und eventuell auch physiko-chemische Unterschiede (Gradient eindringenden Sauerstoffs) zwischen Darmwand und -lumen interpretiert werden können. Der auffälligste Unterschied war eine hohe Abundanz (10 - 15% aller Bakterien) Desulfovibrio-verwandter Bakterien an der Enddarmwand, die sowohl mit PCR-abhängigen als auch PCR-unabhängigen Methoden abgesichert werden konnte. In seiner Eindeutigkeit ist dieser Befund für Arthropoden bislang einmalig.

Summary:
Soil macroinvertebrates play an important role in the transformation of soil organic matter, which is responsible for many key soil functions. During gut passage of ingested soil organic matter, intestinal microorganisms participate in the transformation processes, which are also of great importance for the nutrition of their hosts. However, little is known about the structure of microbial communities in the intestinal tract of most soil macroinvertebrates and their spatial distribution within different gut sections. In fact, particularly the topology of microbial communities is regarded as a prerequisite for a deeper understanding of the functionality of invertebrate intestinal tracts, which are characterized by pronounced axial and radial gradients of important physicochemical parameters. Therefore, in the course of this thesis structure and topology of microbial communities in the intestinal tract of the larva of two scarabaeid beetles (Pachnoda ephippiata and Melolontha melolontha) and in the midgut of the earthworm Lumbricus terrestris were analyzed applying techniques of molecular microbial ecology. Moreover, a novel PCR-artifact, so called pseudo-T-RFs, was detected during this thesis, markedly affecting T-RFLP analysis of microbial communities. Protocols allowing the identification and prevention of pseudo-T-RFs formation were developed and applied. In a T-RFLP-based study with earthworms it could be shown, that the intestinal microbiota of these animals is largely soil-derived, i.e. that they lack a gut-specific flora typical for many other soil invertebrates. It could be shown that the ingested microbial community undergoes significant changes during gut passage and that the differences in microbial community composition between food soil, gut and casts strongly depend on the diet of the earthworms. The studies conducted with scarabaeid beetle larvae were the first comprehensive molecular studies about the gut microbiota of beetle larvae and among the first studies about the gut microbiota of other soil arthropods than termites. It could be shown that the pronounced differences in physicochemical parameters existing between the two major gut sections (midgut and hindgut) of scarabaeid beetle larvae are paralleled by marked differences in the colonization with microorganisms. In contrast to the investigated earthworms, the gut microbiota of the scarabaeid beetle larvae could be regarded as a special gut flora, because its composition was considerably different to the microbial community of the ingested food. In both larval species the midgut section was less densely colonized than the hindgut, which possibly functions as a fermentation chamber. Methanogenesis was always restricted to the hindgut section; in the larva of M. melolontha, Methanobrevibacter-species were identified to account for methane production, in P. ephippiata larvae additionally Methanomicrococcus-species occurred. However, in comparison to Bacteria, diversity and relative abundance of Archaea was low. Phylogenetic analysis of the intestinal bacterial communities revealed a high diversity, obviously comprising many so far uncultivated species. The majority of sequences was affiliated with Actinobacteria, Bacillales, Bacteroidetes, Clostridiales, Lactobacillales, and Proteobacteria; many clones were grouping with clones and isolates from other intestinal systems, which underlined the gut specificity of the intestinal microbiota of the scarabaeid beetle larvae. The affiliation of many clones with hydrolytic, cellulolytic and fermenting isolates corroborated the intestinal fatty acid spectra (dominated by acetate and lactate) and suggests the existence of an anaerobic food chain, at least for the hindgut sections. It is not clear if this also holds true for the midgut, since in case of the Melolontha larvae no stable bacterial community could be proven for this gut section. The Melolontha larvae investigated during this thesis were the first arthropods with which a comprehensive analysis of the microbial community structure of different subcompartmental fractions of major gut sections was performed. The gut wall and lumen fractions of the Melolontha hindgut were found to be differentially colonized by microorganisms, which may reflect adaptations to morphological (occurrence of chitin trees at the hindgut wall) and/or physicochemical (penetration of oxygen into the hindgut periphery) features of the investigated subcompartments. The most noticeable difference between the microbial communities of hindgut wall and lumen was a high abundance (10 - 15% of all bacteria) of Desulfovibrio-related bacteria at the hindgut wall, proven with both PCR-dependent and ?independent methods. Regarding its clearness, this finding is so far unique for arthropods.


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