Dokument

Zusammenfassung:
In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zum Phenylpropanstoffwechsel in zwei Lycopersicon esculentum Mill. Zelllinien durchgeführt. Eine der Zelllinien enthält ein Phenoloxidase (PPO)-Antisense-Konstrukt aus Solanum tuberosum, wodurch die Expression der PPO-Genfamilie herabgesetzt wurde (Thipyapong et al., 1997 b). Aus dieser und der genetisch nicht veränderten Zelllinie sollten Enzyme charakterisiert werden, die die Umsetzung der p-Cumarsäure zur Kaffeesäure katalysieren. Es wurden zunächst die Gehalte einiger phenolischer Inhaltsstoffe der beiden Tomatenzelllinien bestimmt. In beiden Zelllinien liegen größere Mengen Chlorogensäure vor, ein charakteristischer phenolischer Inhaltsstoff von Tomaten. In der transgenen Zelllinie wurden 520 nmol/g TG und in der nicht-transgenen Zelllinie 278 nmol/g TG bestimmt. Die transgene Zelllinie enthält ebenfalls größere Mengen p-Cumarsäure (117 nmol/g TG) und Ferulasäure (60 nmol/g TG). In der nicht-transgenen Kultur ist keine p-Cumarsäure im methanolischen Extrakt zu detektieren, wohingegen die Menge an Ferulasäure (104 nmol/g TG) deutlich höher liegt als in der transgenen Kultur. Nach einer Glucosidase-Behandlung der Extrakte oder einer sauren Hydrolyse zeigte sich ebenfalls, dass in der nicht-transgenen Kultur mehr Ferulasäureverbindungen enthalten sind als in der transgenen Kultur, in der mehr p-Cumarsäurever-bindungen vorliegen. Dies legt die Vermutung nahe, dass ein Zusammenhang besteht zwischen der verringerten Expression der PPOs in der transgenen Kultur und den geringeren Gehalten an Ferulasäureverbindungen. Es wurde ein Enzymtest für PPOs etabliert, bei dem p-Cumarsäure als Substrat verwendet wurde. Es wurde die Zeitabhängigkeit der Monophenolasereaktion für eine Hydroxylierung von p-Cumarsäure zu Kaffeesäure ermittelt, der einen für die Monophenolasereaktion typischen sigmoiden Verlauf zeigte. Die Temperaturoptima für die Monophenolaseaktivität wurden bestimmt. Für die PPOs aus der transgenen Kultur wurde ein Optimum von 35°C ermittelt und für die PPOs aus der nicht-transgenen Kultur von 45°C. Für die PPOs aus der nicht-transgenen Kultur ergab sich ein apparenter Km-Wert für p-Cumarsäure von 101 µM und für die PPOs aus der transgenen Kultur von 46 µM. Diese Km-Werte zeigen, dass eine hohe Affi-nität zwischen dem Substrat und den PPOs besteht. Bei der Ermittlung des pH-Optimums ergab sich für die nicht-transgene Kultur ein Optimum bei pH 4,5 („saure Isoform“) und eine bei pH 7,5 („neutrale Isoform“). Diese pH-Optima ließen sich je einer PPO-Isoform zuordnen. In der transgenen Kultur konnte nur eine PPO-Isoform mit einem pH-Optimum von pH 4,5 ermittelt werden. Die PPOs ließen sich durch Tropolon hemmen. Bei 80 µM Tropolon im Reaktionsansatz sank die Monophenolaseaktivität auf 10%. Ebenfalls konnte die Monophenolasereaktion durch DTT und DIECA stark gehemmt werden, EDTA dagegen begünstigte die Reaktion. Die Substratspezifität für Monophenole wurde untersucht: neben p-Cumarsäure wurde auch p-Cumaryl-Dihydroxyphenyllactat, p-Cumarylchinasäure und 4-Hydroxyphenyl-lactat zu den entsprechenden Dihydroxyverbindungen umgesetzt. Die Substratspezifität der PPOs ist daher eher als gering einzustufen. Es gelang auch, die PPO-Isoformen zu trennen und partiell zu reinigen. Es konnten aus der nicht-transgenen Tomatenzelllinie zwei PPO-Isoformen isoliert und über Anionenaustauschchromatographie getrennt werden, die die Umsetzung von der p-Cumarsäure zur Kaffeesäure bei zwei verschiedenen pH-Werten katalysieren. Eine Isoform katalysierte diese Umsetzung bei einem pH-Wert von 4,5 („saure Isoform“) und die andere bei einem pH-Wert von 7,5 („neutrale Isoform“). In der transgenen Kultur wurde die saure Isoform aufgereinigt, die neutrale PPO-Isoform kommt in der transgenen Kultur nicht vor. Nach einer SDS-Gele-lektrophorese sind in der Fraktion mit der angereinigten „sauren Isoform“ noch zwei Protein-banden mit Molekülmassen von 78 kDa und 60 kDa zu erkennen und in der Fraktion mit der angereinigten „neutralen Isoform“ drei Proteinbanden mit Molekülmassen von 78 kDa, 60 kDa und 52 kDa. Es wurde Gesamt-RNA isoliert und eine RT-PCR mit Primern durchgeführt, die für Teile einer PPO-Gen-Sequenz spezifisch waren. Die PCR-Produkte wurden über Gelelektrophorese analysiert und besaßen die theoretisch zu erwartende Länge, womit belegt werden konnte, dass zu dem Zeitpunkt, an dem die Enzymextraktionen durchgeführt wurden, PPO-mRNA exprimiert wurde.

Das Dokument ist im Internet frei zugänglich - Hinweise zu den Nutzungsrechten