Genomics-driven and biochemical approaches to expand the spectrum of natural products

Naturstoffe (NP), die aus dem Sekundärstoffwechsel lebender Organismen stammen, spielen eine zentrale Rolle bei der Entdeckung von Arzneimitteln, insbesondere solche zur Behandlung von Krebs und Infektionskrankheiten. Ihr vielseitiges Gerüst wird von verschiedenen Biosyntheseenzymen rekonstruiert, darunter Polyketidsynthasen (PKSs), nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPSs), Terpencyclasen und Hybridenzyme. Weitere Modifikationen durch Enzyme wie Oxidoreduktasen, Cytochrom-P450-Enzyme und Prenyltransferasen (PTs) erhöhen die strukturelle Vielfalt und verbessern ihre biologischen und pharmakologischen Aktivitäten. Mit den Fortschritten bei der Genomsequenzierung und den Analysetechnologien wurden viele Strategien angewandt, um die vielversprechenden Kategorien für die Arzneimittelentdeckung zu erforschen. Da die meisten biosynthetischen Gencluster (BGCs) in den Genomen nur schwach oder gar nicht exprimiert sind, ist es von großer Bedeutung, solche promiskuitiven BGCs für die Suche nach neuen Wirkstoffkandidaten zu aktivieren. In den letzten Jahren hat das Genom-Mining neuartiger BGCs erhebliche Fortschritte bei der Entdeckung von NPs ermöglicht. Neben der Erforschung von Sekundärmetaboliten (SMs) in Mikroorganismen haben sich auch die substratbasierten enzymatischen Reaktionen als nützliches Instrument zur Erweiterung der chemischen Datenbank erwiesen. Die Mitglieder der Dimethylallyl-Tryptophan-Synthase (DMATS)-Superfamilie wurden als wichtige Biokatalysatoren in großem Umfang zur strukturellen Veränderung verschiedener niedermolekularer Moleküle eingesetzt. Zahlreiche neue prenylierte Strukturen wurden durch chemoenzymatische Synthese gewonnen. In dieser Arbeit haben wir ein α-Pyron-Derivat durch Genom-Mining eines NRPS-PKS-Gens in Penicillium crustosum identifiziert und eine Reihe von prenylierten Cyclodipeptid (CDP)-Analoga durch chemoenzymatische Synthese verschiedener DMATSs erhalten. Im ersten Projekt wurde ein neuartiges NRPS-PKS-Hybridgen pcr10109 aus Penicillium crustosum PRB-2 von Dr. Jie Fan für eine eingehende Untersuchung ausgewählt. Sie klonierte das Gen in den Expressionsvektor für die heterologe Expression in Aspergillus nidulans. Die Analyse der SMs und die Strukturaufklärung bewiesen, dass das Gen für die Produktion von 4-Hydroxy-6-(4-hydroxyphenyl)-2H-pyran-2-on verantwortlich ist. Weitere Isotopenfütterungsexperimente enthüllten den Biosyntheseweg. para-Hydroxybenzoesäure (PHBA) als Vorstufe und zwei Acetatmoleküle werden zur Bildung des Endprodukts zusammengesetzt. Um die Produktausbeute zu erhöhen, fütterten wir die Kulturen mit PHBA, und die Produktausbeute erreichte ein Maximum von 51 mg/kg Reiskultur, was fünfmal höher ist als die ohne Fütterung. Dies ist eine weitere Möglichkeit, die Produktbildung durch die Zugabe spezieller Substrate zu erhöhen. Im zweiten Projekt konzentrierten wir uns hauptsächlich auf die Produktion von diprenyliertem cyclo-L-Trp-L-Pro (cWP). Zunächst wollten wir der natürlichen Biosynthesemaschinerie folgen, indem wir die C2-PT EchPT1 als ersten Biokatalysator einsetzten. Das C2-prenylierte cWP konnte jedoch nicht von C4-, C5-, C6-, und C7-PTs zur weiteren Prenylierung akzeptiert werden. Dr. Lindsay Coby fand heraus, dass der C2-PT EchPT1 auch die Prenylierungen von monoprenylierten Cyclodipeptiden katalysieren kann. Dann haben wir unsere Strategie geändert und zunächst das C4-, C5-, C6-, C7-monoprenylierte cWP in hoher Produktausbeute erhalten. Anschließend wurden die monoprenylierten Derivate mit EchPT1 für die reverse C2-Prenylierung inkubiert. Enzymtests im großen Maßstab und NMR-Analysen zeigten, dass es sich bei den Produkten um C2,C4-, C2,C5-, N1,C6-, und C2,C7-diprenylierte cWP handelt. Dies ist der erste Bericht, dass EchPT1auch die Prenylierung an der N1-Position des Indolrings katalysieren kann. Im dritten Projekt wurde eine ähnliche Methode für die Bildung von prenylierten Tryptophan-haltigen dimeren CDPs verwendet. Wir wählten verschiedene dimere CDPs und PTs für den Enzymaktivitätstest. Interessanterweise konnten nur die cyclo-L-Trp-L-Trp (cWW)-Dimere Tetratryptomycine A − C von EchPT1 in Gegenwart von DMAPP gut akzeptiert werden. Tetratryptomycine A und C sind, verglichen mit Tetratryptomycin B, bessere Substrate für die Prenylierung durch EchPT1. Die Isolierung der Verbindungen und die NMR-Analyse ergaben, dass es sich bei den Produkten um C2- (und C2'-) prenylierte Tetratryptomycine handelt, was mit EchPT1-katalysierten Reaktionen übereinstimmt. Die weitere Bestimmung der kinetischen Parameter ergab, dass die Werte im Bereich der EchPT1-katalysierten Reaktionen für die meisten CDPs liegen.