Characterization of Type IV-A CRISPR-Cas systems

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas (CRISPR-assoziierte) Systeme sind in vielen Prokaryoten vorhanden und sorgen für eine adaptive Immunität gegen Viren und andere mobile genetische Elemente. Sie können neues fremdes genetisches Material durch Anpassung erkennen, was die Integration kurzer Abschnitte fremder DNA in ein sich erweiterndes CRISPR-Array beinhaltet. Dieser Prozess ermöglicht es dem System, sich ständig weiterzuentwickeln und eine robuste Verteidigung gegen eine Vielzahl von Eindringlingen zu bieten. Je nach den beteiligten Cas-Proteinen werden die CRISPR-Cas-Systeme in verschiedene Typen und zwei Hauptklassen eingeteilt. Systeme des Typs I verwenden einen Ribonukleoprotein-Komplex namens Cascade (CRISPR-assoziierten Komplex für die antivirale Abwehr), um nach eindringender DNA zu suchen und an die Sequenz zu binden, die zu ihrer crRNA (CRISPR-RNA) passt. Sobald das Ziel identifiziert ist, wird die Nuklease Cas3 rekrutiert und baut die DNA in einem Prozess ab, der als Interferenz bekannt ist. Das CRISPR-Cas-System vom Typ IV gehört zur Klasse 1 und hat drei Untertypen. Diese Studie konzentriert sich speziell auf das Typ IV-A-System, das durch das Fehlen einer DNA-Nuklease, das Vorhandensein eines CRISPR-Arrays, das Fehlen eines Anpassungsmoduls und die Assoziation mit der Helikase DinG gekennzeichnet ist. Um die biologische Funktion des Typ IV-A CRISPR-Cas-Systems zu untersuchen, wurde Pseudomonas oleovorans als Modellorganismus ausgewählt und festgestellt, dass es ein einzelnes Typ IV-A CRISPR-Cas-System auf seinem Megaplasmid enthält. Bioinformatische Analysen seines CRISPR-Arrays zeigten, dass eine der crRNAs auf das Gen pilN im Genom abzielt, was auf eine Anpassung der Wirtssequenzen hinweist. Eine 5′-AAG-3′-PAM-Sequenz wurde zwischen den CRISPR-Cas-Systemen des Typs IV-A und des Typs I-E gefunden, was auf die Möglichkeit von Überschneidungen auf der Ebene der Anpassung hindeutet. Die Tiefensequenzierung der genomischen DNA von P. oleovorans-Zellen, die mit Pre-Spacern elektroporiert wurden, ergab Spacer-Umlagerungen und das Vorhandensein neuer Spacer. In vivo-Assays in rekombinanten P. oleovorans- und E. coli-Systemen zeigten, dass das Typ IV-A-System eine PAM-abhängige Interferenz durchführt. Dieses System weist eine Anti-Plasmid-Aktivität auf, indem es auf einen offenen Leserahmen innerhalb einer der zahlreichen Klonierungsstellen abzielt. Darüber hinaus zeigt es Resistenz gegen Lambda-Phageninfektionen, indem es auf das Gen E abzielt, das für ein wichtiges Kopfprotein kodiert. Die Beobachtung eines effizienten lacZ-Reporter-Targetings lieferte den ersten Beweis dafür, dass das Typ IV-A-System Interferenzen ohne DNA-Abbau durchführt. Daher ist das Typ IV-A CRISPR-Cas-System ein vielversprechendes Werkzeug zur Modulation der Transkription mit einem natürlichen CRISPR-ähnlichen Mechanismus.