Quantitative measurements and modelling of bacterial DNA segregation

Eine genaue Segregation von genetischem Material ist für das Überleben und die Vermehrung aller Organismen, ob eukaryotisch oder prokaryotisch, unerlässlich. Neben dem Chromosom sind Bakterien dafür bekannt, extrachromosomale DNA-Moleküle zu tragen, die als Plasmide bezeichnet werden und in bestimmten Situationen Wachstumsvorteile bieten und oft Antibiotikaresistenzen kodieren. Die Kopienzahlen von Plasmiden können je nach spezifischem Plasmid stark variieren, von mehreren hundert Kopien pro Zelle bis zu weniger als einer Handvoll. Plasmide mit hoher Kopienzahl können sich auf ihre Anzahl verlassen, um sicherzustellen, dass mindestens ein Plasmid während der Zellteilung an jede Tochterzelle verteilt wird. Plasmide mit geringer Kopienzahl hingegen benötigen spezielle Partitionierungssysteme, um eine korrekte Segregation sicherzustellen und ihren Verlust während der Zellteilung zu verhindern. Das ParABS-System ist das häufigste dieser Partitionierungssysteme und besteht aus drei Komponenten: parS, einer zentromerähnlichen Sequenz in der Nähe des Replikationsursprungs auf dem Plasmid; ParA, eine Walker-Typ-ATPase, die unspezifisch an das Nukleoid in ihrem dimeren ATP-gebundenen Zustand bindet; ParB ist ebenfalls ein Protein, das Dimere bildet und spezifisch an eine parS-Stelle bindet. Sobald es an parS gebunden ist, breitet sich ParB mehrere Kilobasen in beide Richtungen aus, und zusammen bilden parS und ParB einen Nukleoproteinkomplex. Dieser Komplex interagiert mit nukleoidgebundenem ParA, was zur gleichmäßigen Positionierung von Plasmiden entlang der Längsachse der Zelle führt. Diese Art der Positionierung stellt sicher, dass beide Tochterzellen bei der Zellteilung eine gleiche Anzahl von Plasmiden erhalten. Der Hauptfokus dieser Arbeit liegt auf dem F-Plasmid, einem Plasmid mit geringer Kopienzahl, das ein ParABS-System besitzt und durchschnittlich drei Kopien pro Zelle aufweist. Die Platzierung dieses Plasmids und anderer ParABS-tragender Plasmide innerhalb der Zelle ist Gegenstand von Diskussionen. Einige vermuten, dass Plasmide innerhalb der Zelle durch oszillatorische Bewegung positioniert werden, während andere gerichtete Bewegung vorschlagen, die die Plasmide direkt an ihren Zielpositionen platzieren. Durch den Einsatz von hochdurchsatzdatenerfassung und -analyse konnten wir Tausende von Zellzyklen mit F-Plasmiden erfassen, um die wahren Dynamiken der Plasmidpositionierung dieses Systems aufzudecken. Um die Bewegung des F-Plasmids zu verfolgen, verwenden wir ParB, das an ein fluoreszierendes Protein gekoppelt ist, das mit dem Plasmid kolokalisiert und helle Foci bildet, die leicht verfolgbar sind. Darüber hinaus entwickelten wir basierend auf einem zuvor entwickelten Modell ein vereinheitlichendes Modell, das die in vivo Beobachtungen nicht nur des F-Plasmids, sondern auch eines anderen entfernt verwandten ParABS-Systems (pB171) genau reproduziert. Unsere Ergebnisse, basierend auf experimentellen Daten und Simulationen, zeigen, dass das F-Plasmid eine zielgerichtete und regelmäßige Positionierung aufweist: Die Plasmide bewegen sich präzise zu ihren Zielpositionen und stellen somit sicher, dass sie gleichmäßig in der ganzen Zelle verteilt sind. Unser Modell zeigt, dass das F-Plasmid knapp über der Schwelle einer oszillatorischen Instabilität arbeitet. Wie von unserem Modell vorhergesagt, überschreitten große Zellen mit einem einzigen Plasmid diese Schwelle. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen mit einem anderen Plasmid, den pB171-Plasmiden, bei niedrigen Plasmidkonzentrationen deutliche Pol-zu-Pol-Oszillationen, aber wenn die Konzentration zunahm, wurden die Plasmide regelmäßig positioniert. Trotz dieser signifikanten Unterschiede in der Plasmidbewegung konnte unser Modell diese unterschiedlichen Plasmiddynamiken mit einem einzigen dimensionslosen Parameter namens lambda erklären, der die durchschnittliche Diffusionsstrecke von ParA auf dem Nukleoid beschreibt. Weiterhin ergaben unsere Simulationen ein interessantes Ergebnis: Wenn sich das System dem oszillatorischen Regime näherte, verringerte sich sein Energieverbrauch. Dieser Fund liefert eine mögliche Erklärung dafür, warum diese Systeme so nahe zur oszillatorischen Instabilität arbeiten. Eine Herausforderung, auf die wir während der Untersuchung des ParABS-Systems stießen, war die Schwierigkeit, Plasmide bei hohen Zahlen genau zu verfolgen. Um dieser Herausforderung zu begegnen, entwickelten wir einen Algorithmus namens *Track, der beständige Objekte wie Plasmide mit hoher Genauigkeit verfolgt. Wir testeten diesen Algorithmus sowohl für F-Plasmide als auch für chromosomale Loci und machten interessante Beobachtungen und Erkenntnisse in beiden Systemen. Aufbauend auf unseren bisherigen Ergebnissen untersuchten wir auch das Zusammenspiel zwischen Plasmidbewegung und ParA-Lokalisierung. Es ist bekannt, dass ParA von einer Zellhälfte zur anderen oszilliert, aber die Funktion und biologische Relevanz dieser Oszillationen sind unbekannt. Durch den Einsatz von Hochdurchsatz-Datenerfassung und -analyse identifizierten wir die Merkmale dieser Oszillationen und fanden heraus, dass sie zum Vorschein kommen, sobald das Nukleoid eine Verengung aufweist. Wir schlagen vor, dass dieser Effekt eine Folge der "ParA-ParA-Rekrutierung" ist, bei der nukleoidgebundenes ParA zytosolisches ParA rekrutiert, um in enger Nähe den Nukleoid zu binden. Um diese Behauptung zu unterstützen, haben wir die ParA-ParA-Rekrutierung in unser Computermodell integriert, was es uns ermöglichte, die in vivo beobachteten Oszillationen von ParA genau nachzubilden. Unsere Hypothese für die biologische Relevanz dieses Mechanismus ist, dass ParA-Oszillationen dem System ermöglichen, Plasmide zwischen zwei getrennten Schwester-Nukleoiden vor der Zellteilung aufzuteilen, wodurch eine symmetrische Vererbung der Plasmide an den Nachwuchs ermöglicht wird. Zusammenfassend präsentiert diese Dissertation neue Erkenntnisse über das ParABS-System und seine Rolle bei der präzisen Segregation von Plasmiden. Unsere Ergebnisse ebnen den Weg für zukünftige Forschungen, um die Feinheiten dieses komplexen, aber minimalistischen Systems weiter zu entschlüsseln.