Genome mining-directed discovery of novel 2,5-diketopiperazines from actinobacteria

Naturstoffe aus Cyclodipeptiden (CDPs) mit einem 2,5-Diketopiperazin (DKP) als Grundgerüst sind wichtige Vertreter von Sekundärmetaboliten. Insbesondere Indolalkaloide, die sich von tryptophanhaltigen CDPs ableiten, sind weit verbreitet in Bakterien, Pilzen und Pflanzen. Sie spielen aufgrund ihrer vielseitigen biologischen und pharmakologischen Aktivitäten eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Arzneistoffen. In der Natur wird das DKP von zwei verschiedenen Enzymfamilien gebildet, entweder von nichtribosomalen Peptidsynthetasen oder von aminoacyl-tRNA-abhängigen Cyclodipeptidsynthasen (CDPSs). Anschließend können diverse Enzyme, z.B. FAD-abhängige Oxidoreduktasen, Cytochrom P450, Cyclodipeptidoxidasen (CDOs), Methyltransferasen oder Prenyltransferasen das DKP-Grundgerüst durch Einführung verschiedener funktioneller Gruppen modifizieren. Hierdurch entsteht eine Vielzahl an chemischen Verbindungen. Obwohl CDPSs eine erst kürzlich entdeckte Enzymfamilie darstellen, sind bereits viele unterschiedliche Vertreter gefunden worden. Jedoch wurden nur wenige Biosynthesewege inklusive modifizierender Enzyme vollständig aufgeklärt. Seit einigen Jahren wächst die Anzahl sequenzierter Genome von Mikroorganismen in öffentlichen Datenbanken stetig, sodass etliche nicht aktive oder kryptische Gencluster identifiziert werden konnten. Diese Gencluster weisen großes Potential zur Entdeckung neuer Sekundärmetabolite einschließlich 2,5-DKPs auf. Daher stellt die vollständige Aufklärung solch unerforschter Gencluster einen vielversprechenden Ansatz für die pharmazeutische Industrie dar, um das Spektrum an 2,5-DKPs zu erweitern. In meinem ersten Projekt, in Zusammenarbeit mit Dr. Huili Yu, haben wir auf Basis phylogenetischer Analysen elf CDPSs aus verschiedenen Streptomyces-Stämmen zur genaueren Untersuchung ausgewählt. Ihre Funktion konnte durch heterologe Expression in Escherichia coli aufgeklärt werden. Hierzu wurden die für die CDPSs kodierenden Genabschnitte einzeln in den pET28a (+)-Vektor kloniert und anschließend im E. coli soluBL21 Host überexprimiert. Danach wurden die Transformanten in Flüssigmedium kultiviert, extrahiert und deren Produkte per LC-MS und NMR-Analyse strukturell aufklärt. Dabei haben wir neun CDPSs für die Synthese tryptophanhaltiger Cyclodipeptide (cWXs) identifiziert. Dementsprechend handelt es sich bei diesen neun CDPSs um neue Mitglieder der CDPS-Familie, die die Biosynthese tryptophanhaltiger CDPs katalysieren. Genauer gesagt handelt es sich um eine cyclo-L-Trp-L-Leu-Synthase, zwei cyclo-L-Trp-L-Pro-Synthasen, drei cyclo-L-Trp-L-Trp-Synthasen sowie drei unspezifische CDPSs, die als Hauptprodukt cyclo-L-Trp-L-Ala oder cyclo-L-Trp-L-Phe bilden. Unter optimierten Kultivierungsbedingungen konnten wir Ausbeuten von 46 - 211 mg/L erzielen. In letzter Zeit ist den tryptophanhaltigen DKPs vermehrte Aufmerksamkeit zuteil geworden, da ihr Grundgerüst ein vielversprechender Vorläufer für strukturelle Modifizierungen ist. Unsere Arbeit bietet daher eine valide, experimentelle Basis für die synthetische Biologie, um durch Kombinationen mit anderen nachgeschalteten Enzymen weitere interessante Verbindungen zu generieren. Nach erfolgreichem Abschluss des ersten Projekts konnte ich durch weitergehende Sequenzanalysen der für cWX Synthasen kodierenden Gene bei acht von neun Genen jeweils ein Gen in unmittelbarer Nachbarschaft finden, welches mutmaßlich für Cytochrom P450-Enzyme kodiert. Hierbei habe ich mich auf zwei Gencluster aus Streptomyces monomycini NRRL B-24309 bzw. Streptomyces varsoviensis NRRL B-3589 konzentriert. Die beiden CDPS-Gene gutA24309 bzw. gutA3589 sind von vier weiteren Genen, die für drei Enzyme kodieren, umgeben ̶ nämlich einer Cyclodipeptidoxidase, einem Cytochrom P450 und einer Methyltransferase. Nach heterologer Expression dieser biosynthetischen Gencluster in Streptomyces coelicolor konnte ich acht außergewöhnliche und neue Guanitrypmycine strukturell aufklären, welche an Position C3 des Tryptophanrestes guanyliert sind. Durch unterschiedliche Kombinationen der einzelnen Gene sowie Zufütterungsversuche konnte ich die einzelnen Schritte der Guanitrypmycin-Biosynthese entschlüsseln. Das von der CDPS GutA gebildete CDP wird im ersten Schritt durch die CDO Gut(BC) am Phenylalanin- bzw. am Tyrosinrest oaxidiert. oxidiert. Danach überträgt das P450 GutD ein Guanin auf den Tryptophanrest und anschließend wird der Stickstoff an Position 9′ des Guaninrestes durch die Methyltransferase GutE methyliert. Darüber hinaus wird das Spektrum der Guanitrypmycine durch nicht-enzymatische Epimerisierung in Form einer Keto-Enol-Tautomerie erweitert. Anhand weiterführender biochemischer Untersuchungen konnte die Funktion des Cytochrom P450 GutD als Schlüsselkatalysator dieser bisher beispiellosen, regio- und stereoselektiven 3α-Guanylierung des Tryptophanrestes bestätigt werden. Diese Arbeit unterstreicht, wie aussichtsreich CDPSs beinhaltende Biosynthesewege als Quelle neuer biochemischer Reaktionen und der damit verbundenen Entdeckung unbekannter Naturstoffe sind. In gleicher Herangehensweise habe ich zwei weitere CDPSs in Saccharopolyspora antimicrobica mittels Genomanalyse entdeckt, die mit P450s zusammen lokalisiert sind. Durch heterologe Expression, biochemische Untersuchung und LC-MS und NMR-gestützter Strukturaufklärung konnte ich beweisen, dass die zwei P450s TtpB1 und TtpB2 die regio- und stereospezifische Dimerisierung zweier cyclo-L-Trp-L-Trp katalysieren. Diese Art der Dimerisierung war zuvor nicht in Bakterien bekannt. TtpB1 ist das erste identifizierte P450, welches eine stereospezifische C3 (sp3)–C3′ (sp3) Bindung verknüpft, jeweils gegenüber zu H-11 bzw. H-11′. TtpB2 ist hingegen das erste P450, welches eine ungewöhnliche Bindung zwischen dem C3 (sp3) der Hexahydro-Pyrroloindoleinheit und dem N1′ des Tryptophanrestes einfügt. Hiermit konnte ich das Repertoire an DKP-modifizierenden Enzymen signifikant erweitern und darüber hinaus einen einfachen, direkten und effizienten Weg zur enzymatisch kontrollierten Synthese für synthetisch schwer zugängliche DKP-Dimere aufzeigen.