Photoswitchable Peptides as Tools for Lightcontrolled Modulation of Epigenetic Protein Complexes

Die vorliegende kumulative Dissertationsschrift besteht aus zwei publizierten Manuskripten in Chemical Science und ChemBioChem, einem eingereichten Manuskript und einem veröffentlichten Review in Chemical Communications, welches die optochemische Kontrolle über biologische Prozesse unter Anwendung fotoschaltbarer Peptide behandelt. Außerdem werden in dem Review grundlegende Prinzipen der eingesetzten Fotoschalter, die Techniken ihrer Inkorporierung in Peptide, sowie deren struktureller Eigenschaften diskutiert. Darüber hinaus beinhaltet diese Thesis eine allgemeine Übersicht der Epigenetik. Hierbei liegt der Schwerpunkt auf dem Methyltransferase MLL1-Komplex und dessen Inhibitoren, welche die Protein-Protein Interaktion (PPI) zwischen MLL1 und WDR5 als Target adressieren. Dem kumulativen Teil folgt ein Fazit und ein Ausblick sowie ein weiterer Abschnitt über zusätzlich durchgeführte Experimente, welche nicht in den Manuskripten diskutiert wurden. Während der letzten Jahre verfolgten wir das Ziel, die Kontrolle über epigenetische Zustände mit Hilfe fotoschaltbarer Peptide zu erlangen. Hierbei lag unser Augenmerk auf der Histon Methyltransferase Mixed-Lineage-Leukemia 1 (MLL1), auch bekannt unter dem Namen Lysin [K]-spezifische Methyl Transferase 2A (KMT2A), einem vielversprechenden Target in der Krebstherapie. Die enzymatische Aktivität von MLL1 ist abhängig von der Formation eines Protein-Protein Komplexes (MLL1, WDR5, RbBP5, Ash2L, DPY30), wobei insbesondere die Interaktion zwischen MLL1 und WDR5 von essentieller Bedeutung ist. Diese PPI ist notwendig um die Bindung des RbBP5-Ash2L Dimers an MLL1 zu gewährleisten und somit die katalytisch aktive offene Konformation der SET1-Domäne von MLL1 zu stabilisieren. Basierend auf bekannten WDR5-bindenden Peptiden haben wir fotoschaltbare Analoga entwickelt, um somit die MLL1-WDR5 Interaktion reversibel zu inhibieren. Zunächst haben wir das klassische Azobenzol 4-[(4’-aminomethyl)phenyl-azo]benzoic acid (AMPB) in ein MLL1 Peptidderivat (H2N-SARAEVHLRKS-CONH2) eingebaut um somit eine lichtgesteuerte Konformationsänderung zwischen den beiden Isomeren zu erzeugen, was letztendlich zu einer kontrollierbaren Inhibierung der MLL1 Aktivität führen sollte. Fluoreszenz-Polarisations (FP) Assays zeigten, dass das Peptid: H2N-SARA-AMPB-VHLRKS-CONH2 den vielversprechendsten Kandidaten unserer Peptid-Bücherei darstellte, da es sowohl die höchste Differenz in Bindungsaffinität zwischen den Isomeren aufwies (Ki (trans) = 1.25 ± 0.36 nM versus Ki (cis) = 6.50 ± 1.4 nM), als auch um eine Größenordnung gesteigerte Affinität zum originalen MLL1 Peptid besaß. Mit Hilfe der Co-Kristallstruktur (PDB: 5M23) konnten wir diese gesteigerte Affinität erklären. So sorgte eine weitere Wasserstoffbrückenbindung des ersten Stickstoffs der N=N-Azo Doppelbindung zum Lys259, sowie van der Waals Interaktionen zwischen dem zweiten Benzolring des AMPBs zum Tyr260 für zusätzliche Stabilität. Weiterhin wies unser Peptid nicht nur eine hohe Bindungsaffinität zu WDR5 auf, sondern war außerdem in der Lage die MLL1 Aktivität zu inhibieren. Hervorzuheben ist, dass die Differenz zwischen den Isomeren auf das 15-fache erhöht werden konnte (HMT Aktivität IC50 (trans) = 0.531 ± 0.023 µM; IC50 (cis) = 8.23 ± 0.38 µM). Dies zeigt erstmalig die lichtgesteuerte Modulierung von Histonmethyltransferasen. Die präzise Kontrolle von MLL1 spielt eine entscheidende Rolle in der Regulierung der Transkription von Genen, welche in der Hämatopoese und Entwicklung involviert sind. So ist die Trimethylierung von Histon 3 Lysin 4 (H3K4) mit transkriptional aktiven Genen assoziiert. Da MLL1 adressierte Gene, wie hox und deptor, in diversen Leukämiearten stark überexprimiert vorliegen, haben wir den Effekt unseres Peptids auf die Viabilität von Leukämie Zellen (MLL-AF9 Maus Knochenmark Zellen) getestet. Hierfür verknüpften wir unsere Verbindung mit zellpenetrierenden Peptiden (Cell Penetrating Peptides, CPPs), um die Aufnahme in die Zelle zu gewährleisten. Die Zell-Viabilitäts Assays verifizierten die effektive Inhibierung des Zell-Wachstums mit einem deutlichen Unterschied zwischen den beiden Isomeren bis zu einem Faktor von 1.52 (GI50 (trans) = 2.14 ± 0.10 µM, GI50 (cis) = 3.25 ± 0.23 µM). Schließlich testeten wir, anhand von Reversibler Transkriptase Echtzeit quantitativer PCR (RT-qPCR), ob unser vielversprechendster Kandidat in der Lage ist, die Transkription des MLL1 assoziierten Gens deptor zu regulieren. Erfreulicherweise bewiesen diese Experimente, dass unser Peptid tatsächlich als optoepigenetischer Inhibitor dient, da er die Expression von deptor, abhängig vom Fotoisomer, herabreguliert (relative Expressionslevel von deptor: trans = 0.23%; cis = 0.36%, p = 0.008). Diese proof-of-concept Ergebnisse wurden in Chemical Science veröffentlicht. Nachdem das Potential der fotopharmakologischen Inhibierung von MLL1 etabliert war, wollten wir diese optimierte biologische Plattform nutzen, um unsere fotoschaltbaren Peptide weiter zu entwickeln. Spezifisch formuliert, sollte die Differenz des biologischen Outputs zwischen den Isomeren vervielfältigt, sowie die fotochromen Eigenschaften verbessert werden. Folglich haben wir die Synthese zweier neuartiger fotoschaltbarer Aminosäurebausteine entwickelt: ein Fmoc-geschütztes cyclisches Azobenzolanalogon von 5,6-dihydrodibenzol[c,g][1,2]diazocine (Fmoc-cAzoAA) sowie ein Mtt-ethylenediamin geschütztes tetra-ortho-fluoroazobenzol (Mtt-oF4AzoAA). Abgesehen von der Vermeidung von UV-Licht für die Isomerisierung, weist der oF4Azo Fotoschalter höhere Fotokonversionen auf als der vorige AMPB Schalter (95% cis; 86% trans). Inkorporierung in dasselbe MLL1 Peptid führte jedoch nicht zu einer erhöhten Differenz in WDR5-Bindungdaffinität zwischen den Isomeren (H2N-SARA-cAzo-VHLRKS-CONH2 Ki (trans) = 140 ± 35 nM, Ki (cis) = 207 ± 52nM; H2N-SARA-oF4Azo-VHLRKS-CONH2 Ki (trans) = 11.8 ± 1.4 nM, Ki (cis) = 30.8 ± 3.3 nM). Struktur-Aktivitäts Relationen (SARs), abgeleitet von Kristallisationsstudien, sowie theoretischen Berechnungen wiesen erhebliche Unterschiede in der Positionierung der Azobenzoleinheiten auf. Dieses Projekt wurde in ChemBioChem veröffentlicht und als Front Cover ausgezeichnet. Schließlich kombinierten wir den oF4Azo Fotoschalter mit einem strukturell definierten Grundgerüst, um somit die Differenz zwischen den Isomeren zu maximieren. Basierend auf dem Grundgerüst des MLL1 Inhibitors MM-401: ((H3C)2CHCO-NH-c[D-Lys-Arg-Abu-D-Phg]#) wurden insgesamt 14 cyclische Peptidderivate entworfen und synthetisiert. FP-basierte Assays zeigten, dass der Kandidat: (H3C)2CHCO-NH-c[D-Dab-Arg-Abu-D-Phe-oF4Azo]# eine Zunahme der WDR5-Affinitätsdifferenz zwischen Isomeren (Ki (trans) = 78.6 ± 3.4 nM, Ki (cis) = 7.99 ± 0.79 nM) um 50% im Vergleich zu unserem vorigen AMPB-Peptid aufwies. Dies bestätigte, dass cyclische Grundgerüste zu erhöhten Modulationspotentialen führen als lineare Analoga. Im Gegensatz zum linearen AMPB-Peptid zeigte das cis Isomer sowohl eine höhere WDR5-Affinität, als auch bessere MLL1-Inhibierungskapazitäten im Vergleich zum trans Isomer: IC50 (trans) = 6.68 ± 3.1 µM; IC50 (cis) = 0.649 ± 0.3 µM. Kristallisations-studien sowie molekulare Dynamik-Simulationen (MD) kombiniert mit virtuellen Dockingstudien (VD), Pull-Down Assays und Wasserstoff-Deuteriumaustausch (Hydorgen Deuterium Exchange, HDX) verifizierten die Verbesserung der WDR5-Affinitäts Differenz sowie dessen Auswirkung auf die gesamte MLL1-Komplex Topologie. Mit Hilfe von HDX-MS Experimenten konnten wir zeigen, dass der Aktivitätsverlust durch Zugabe unseres cis Inhibitors unter anderem durch allosterische Umlagerungen der WDR5-RbBP5 Bindungsstelle hervorgerufen wird. Dies hat möglicherweise zur Folge, dass das RbBP5-Ash2L-Dimer nicht weiter in der Lage ist, die katalytisch aktive Konformation der SET1-Domäne von MLL1 zu stabilisieren, was zu deren Aktivitätsverlust führt. Des Weiteren besitzen unsere cyclischen Peptidkandidaten verbesserte photochrome Eigenschaften und verhalten sich wie ein quasi-bistabiles System. In der Tat sind beide Isomere bis zu fünf Monate beständig. Darüber hinaus haben wir untersucht, ob der Verlust der enzymatischen Aktivität von MLL1, die Viabilität menschlicher Leukämiezellen modulieren kann. Die Aufnahme in die Zelle, mit Hilfe eines Carrier-Peptids, variierte für verschiedene Zelltypen. So erwies sich die MLL-AF9 Zelllinie, welche für die Experimente im Chemical Science verwendet wurde, als untauglich. Die besten Ergebnisse wurden hingegen mit MOLM-13 Zellen erzielt, bei welchen Viabilitätsunterschiede von: trans: 37%, cis: 0% bei 200 µM and trans: 57%, cis: 26% bei 100 µM festgestellt wurden. Um auszuschließen, dass die beobachtete Toxizität von der oF4Azo Einheit selbst herrührt, wurde das Enantiomer unseres besten cyclischen Peptids, bei dem zusätzlich das Arg mit einem D-Lys substituiert wurde (D-Lys Variante), für die Zell Experimente eingesetzt. Zusätzlich wurde ein extra Waschschritt der Zellen nach der Cargo-Transfektion eingebaut, um sicherzustellen, dass die erfassten Effekte ausschließlich von intrazellulären Mechanismen resultieren. Diese Experimente mit der D-Lys Variante, welche außerdem keine WDR5 Affinität aufweist, bewiesen, dass die Toxizität nicht von der oF4Azo Einheit herrührt, da bei 100 µM eine geringe Toxizität beobachtet wurde, welche noch geringer für das aktive cis Isomer ausfiel (Viabilität: trans: 70%, cis: 91%). Im Gegensatz dazu verursachte das aktive cis Isomer unseres besten Arg-beinhaltendem Kandidaten unter gleichen Bedingungen eine hohe Toxizität, während das trans Isomer gleichbleibende Effekte aufwies (Viabilität: trans: 66%, cis: 24%). Schließlich wollten wir den in vivo Effekt unseres fotoschaltbaren Inhibitors auf die Modulierung von Hämatopoese untersuchen. Aufgrund der Konservierung von MLL1 haben wir uns hierbei für das Zebrafisch Modell entschieden. Dort ist bekannt, dass MLL1 Knockout zur Unterdrückung der Hämatopoese führt, was anhand eines verminderten Blutflusses mit Hilfe von o-Dianisidine Färbung beobachtet werden kann. Unsere Experimente konnten bestätigen, dass das cis Isomer die Hämatopoese in 3 dpf (days post fertilization) Zebrafischen beeinflusst (o-Dianisidine Färbung: 60% stark gestört, 40% keine Färbung). Außerdem wiesen cis inkubierte Zebrafische gekrümmte Körperachsen, Herzödeme und mangelndes Reaktionsvermögen auf. Im Gegensatz dazu wiesen 100% der trans inkubierten, sowie DMSO- und Wasser Kontrollfische keine dieser Defekte auf. Die Isomerisierung unseres Peptids mit sichtbarem Licht ermöglichte uns, zu untersuchen ob trans inkubierte Zebrafische in situ aktiviert werden können. Mit Hilfe dieses Experiments konnten wir beweisen, dass die signifikanten Unterschiede zwischen den Isomeren tatsächlich durch in situ Bestrahlung zum aktiven cis Isomer erreicht werden können (o-Dianisidine Färbung: 3% intakt, 30% gestört, 67%: keine Färbung). Zusammengenommen präsentieren unsere Ergebnisse die Möglichkeit der in vivo Modulierung von MLL1-abhängiger Hämatopoese unter Verwendung cyclischer fotoschaltbarer Peptide. Dieses Projekt wurde kürzlich eingereicht.