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Molekularbiologische Untersuchungen von Nicht-ribosomalen Peptidsynthetase-ähnlichen Enzymen aus Ascomyceten
Zusammenfassung Mikroorganismen haben im Laufe ihrer Evolution zur Anpassung an ihren Lebensraum eine Vielfalt an strukturell diversen und zum Teil sehr komplexen Metaboliten entwickelt. Diese verschaffen ihnen Vorteile gegenüber anderen Bewohnern ihrer Umwelt. Die Nutzung dieser Substanzen führte...
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| 1. Verfasser: | |
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| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2020
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Zusammenfassung
Mikroorganismen haben im Laufe ihrer Evolution zur Anpassung an ihren Lebensraum eine Vielfalt an strukturell diversen und zum Teil sehr komplexen Metaboliten entwickelt. Diese verschaffen ihnen Vorteile gegenüber anderen Bewohnern ihrer Umwelt. Die Nutzung dieser Substanzen führte zur Entwicklung von Antibiotika, Immunsuppressiva und Zytostatika. Hierbei zeigen sich besonders die Enzymklassen der Polyketidsynthasen (PKS), nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS), NRPS/PKS-Hybride und NRPS-ähnliche Enzyme für die Synthese der Grundgerüste der Sekundärmetabolite verantwortlich. Die so entstandenen Substanzen können durch andere Enzyme (tailoring enzymes) wie beispielsweise Methyltransferasen oder Prenyltransferasen weiter modifiziert werden, wodurch oftmals die biologische Aktivität gesteigert wird. Zur fermentativen, semisynthetischen oder chemoenyzmatischen Herstellung dieser Naturstoffe und deren Derivate ist ein detailliertes Wissen der Biosynthese der beteiligten Enzyme Voraussetzung. Obwohl die individuellen Domänen von NRPS und PKS inzwischen biochemisch und strukturell sehr gut untersucht sind, ist das Verständnis für die Interaktion der Domäne und die ablaufenden Mechanismen noch sehr gering. Da sich einfache Systeme wie die NRPS-ähnlichen Enzyme leichter untersuchen lassen, sollten in der vorliegenden Arbeit alle NRPS-ähnlichen Enzyme mit einer A-T-TE Enzymstruktur aus Aspergillus terreus (A. terreus) und ein weiteres aus Chaetomium globosum (C. globosum) charakterisiert werden.
Zunächst sollten die NRPS-ähnlichen Gene apvA, melA, atrAAt, pgnA aus A. terreus mit der eigenen Promoter- und Terminatorsequenz heterolog in Aspergillus nidulans exprimiert werden. Obwohl eine Integration für melA und atrAAt ins Genom beobachtet wurde, konnte in den Ethylacetatextrakten der Kulturüberstände kein Produkt nachgewiesen werden.
Für die Expression der NRPS-ähnlichen Gene in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) sollten die Gene von cDNA bzw. gDNA amplifiziert werden. Hierdurch konnte die Exon-Intron Struktur für apvA, melA, btyA und atrAAt korrigiert werden. Des Weiteren konnte die Domänen Architektur für das putative NRPS-ähnlich Gen atrAAt, das laut der NCBI-Datenbank nur aus einer A- und einer T-Domänen bestand, durch die Amplifikation von cDNA zu einer A-T-TE-Struktur korrigiert werden. Die NRPS-ähnlichen Gene haben etwa eine Größe von 2763-2874 bp und kodieren entsprechend für 920-958 AS lange Proteine. Eine Expression der sieben NRPS-ähnlichen Gene in S. cerevisiae führte zu den fünf Produkten Aspuvinon E, Butyrolacton IIa, Atromentin, Phenguignarsäure und Didemethylasterrichinon D. Die Produkte wurden extrahiert und die Strukturen mittels Massenspektrometrie und NMR-Spektroskopie aufgeklärt. Auf einem Liter Kultur konnten für Aspulvinon E und Phenguignarsäure eine Produktion von 13 bzw. 15 mg und für Butyrolacton IIa sogar bis zu 35 mg berechnet werden.
In anschließenden Versuchen zur Isolierung der NRPS-ähnlichen Proteine stellte sich heraus, dass Affinitäts-Tags am C-Terminus die Enzymaktivität stark hemmt. Ein N terminaler His6-Tag hatte hingegen keinen negativen Einfluss auf die Aktivität. Anhand des Proteinnachweises mit Hilfe eines Western Blotes wurde der optimale Zeitpunkt für die Isolierung auf etwa 16 Stunden nach der Induktion der Proteinexpression durch Galaktose festgestellt. Die rekombinanten Proteine konnten mit einer Konzentration von etwa 1 ml/l Kultur aufgereinigt werden. Allerdings konnte keine katalytische Aktivität nachgewiesen werden. Für ein alternatives Expressionsystem in Escherichia coli wurden die NRPS-ähnlichen Gene sowie das Phosphpantethenyltransferase Gen npgA in die Vektoren pQE60 und pET28a(+) kloniert. Die Expression konnte aus Zeitgründen nicht mehr durchgeführt werden.
Die A-T-TE Domänen der NRPS-ähnlichen Enzyme bilden theoretisch autonome Einheiten, die zwischen den Enyzmen ausgetauscht werden können. Um diese Theorie zu überprüfen und um zusätlich für die NRPS-ähnlichen unnatürliche Produkte zu generieren, sollten die das Substrat aktivierenden A-Domänen mit den TE-Domänen, die für Dimerisierung verantwortlich sind, kombiniert werden. Dafür wurden die A-Domänen von Pgna, ApvA, AstA und AtqA, die Phenyl-; 4-Hydroxy-bzw. Indolpyruvat aktivieren, mit der TE-Domäne von AvpA, BtyA, PgnA, AtrAAt bzw. AstA rekombiniert. Die T-Domäne wurde jeweils von einem der ursprünglichen Enzyme übernommen. Insgesamt wurden 34 Konstrukte hergestellt, die zur Expression in S. cerevisiae verwendet wurden. Für 22 konnten die erwarteten Produkte nachgewiesen und anhand der [M+H-] - Ionen und deren Fragmentierungen sowie NMR-Spektroskopie aufgeklärt werden. So konnten Indolbutyrolacton und Indolguignarsäure synthetisiert werden, welche zuvor noch nie in der Literatur beschrieben worden waren.
Weiterhin ist bekannt, dass die durch die NRPS-ähnlichen Enyzme hergestellten Produkte oft nur das Grundgerüst für Sekundärmetabolite bilden. Daher wurde die nähere genetische Umgebung der NRPS-ähnlichen Gene untersucht. Es wurden 4 Prenyltransferasegene identifiziert, die zur Ko-Expression mit den NRPS-ähnlichen ausgewählt wurden. Leider konnte das prenylierte Produkt in den Transformaten der Bäckerhefe nicht detektiert werden. |
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| Umfang: | 206 Seiten |
| DOI: | 10.17192/z2021.0054 |