Neue Werkzeuge für Hydra zur Untersuchung von Rho- und PtdInsP- vermittelten Signalwegen

In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass die Inhibition unterschiedlicher Komponenten des FGFR-Rho-ROCK-Myosin II- Signalweges jeweils den gleichen Phänotyp bei Hydra erzeugt und das Ablösen der Knospe verhindert. Dabei konnte deutlich gemacht werden, dass die Knospung ein komple...

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Bibliographic Details
Main Author: Apel, David
Contributors: Hassel, Monika (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2020
Biologie
Subjects:
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Description
Summary:In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass die Inhibition unterschiedlicher Komponenten des FGFR-Rho-ROCK-Myosin II- Signalweges jeweils den gleichen Phänotyp bei Hydra erzeugt und das Ablösen der Knospe verhindert. Dabei konnte deutlich gemacht werden, dass die Knospung ein komplexer, zeitlich exakt abgestimmter Prozess ist, der final in einer Akkumulation des Aktins an der Knospenbasis resultiert, die mit der Phosphorylierung von Myosin II korreliert (Holz et al., 2017; Holz et al., 2020). Ein Hauptregulator der Aktindynamik und der Aktomyosin-Kontraktion sind die kleinen Rho- GTPasen (Fagotto, 2014; Fagotto et al., 2013; Menke und Giehl, 2012). Durch eine Datenbankanalyse mittels BLAST der humanen RhoA- GTPase konnten vier homologe Rho- GTPasen in Hydra identifiziert werden. Phylogenetische Untersuchungen zeigten, dass sich Hv_Rho1-3 deutlich innerhalb der RhoABC- Subfamilie gruppieren, während sich Hv_Rho4 basal zu der Subfamilie einordnet. In-situ-Hybridisierungen zeigten, dass die vier Rho- GTPasen in Hydra an morphogenetisch aktiven Geweberegionen exprimiert werden, wobei vor allem Hv_Rho1 und Hv_Rho2 vermutlich an zellulären Prozessen an der Knospenbasis beteiligt sind. Um aktives RhoA nachzuweisen kann neben der immunhistochemischen Antikörperfärbung das Fusionsprotein RBD-GFP genutzt werden, welches durch die Rho-Binde-Domäne (RBD) spezifisch an aktives RhoA bindet (Berger et al., 2009). Das exprimierte und aufgereinigte Fusionsprotein RBD-GFP konnte als neue Methode zur Detektion von aktiven RhoA- homologen Rho- GTPasen in fixiertem Hydra-Gewebe etabliert werden. Dadurch konnten aktive RhoA- homologe Rho- GTPasen in evaginierenden- (Knospe oder Tentakel) und kontrahierenden Geweben (Knospenbasis und Regeneration) nachgewiesen werden. Die in-silico Analyse der Rho- GEFs Kalirin und Trio verdeutlichte eine komplexe und evolutionär interessante Entwicklung der Rho- GEFs, bezüglicher dynamischer Verluste und Gewinne von spezifischen Proteindomänen. In Hydra konnte interessanterweise lediglich eine Kalirin- homologe Sequenz identifiziert werden, welches möglicherweise die Verbindung zwischen membranständigen Lipiden und Rho- GTPasen vermittelt. Neben dem Rho-ROCK-Myosin II- Signalweg wurde die Beteiligung der Phosphatidylinositolphosphate (PtdInsP) an morphogenetischen Prozessen in Hydra untersucht. Erzeugte transgene Hydra- Linien dienen als wertvolles Werkzeug, um die Aktivität der Phopholipase C (PLC) und der PI3- Kinase live und in vivo beobachten zu können. So konnte die Aktivität der PLC an der Knospenbasis während des Knospungsprozesses sowie die Aktivität der PI3- Kinase an der Schnittstelle während der Regeneration nachgewiesen werden. Weiterhin konnte mit erzeugten PtdInsP-GFP- Sensor Transgenen die apikale Lokalisation des PtdIns(4,5)P2 sowie die basale Lokalisation des PtdIns(3,4,5)P3 nachgewiesen werden. Zur detaillierten in vivo Beobachtung und vor allem zur in vivo Mikroskopie der zellulären Lokalisation der PtdInsP-GFP- Sensoren wurden unterschiedliche Relaxantien getestet, wobei lediglich Linalool und Benzocain eine effektive Immobilisierung bei Hydra erzielten. Beide Relaxantien hatten keinen signifikanten Einfluss auf den Prozess der Knospung oder auf den Prozess des Wundverschlusses nach einem Einschnitt. Die Analyse der Aktinfasern verdeutlichte jedoch, dass Linalool im Gegensatz zu Benzocain, das Aktinzytoskelett des Polypen störte, indem es die Faserlänge deutlich verkürzte und zu einer fehlerhaften Faserorientierung führte. Die Daten der vorliegenden Arbeit zeigen, dass mit dem Fusionsprotein RBD-GFP und mit den PtdInsP-GFP- Sensor transgenen Hydren basierend auf existierenden Werkzeugen für die Analyse der Morhphogenese bei Vertebrata und Fliege, zwei interessante methodische Werkzeuge für Hydra etabliert werden konnten. Erstmals konnte dadurch die Aktivität der Rho- GTPasen an der Knospenbasis während der Knospung sowie die zelluläre Lokalisation von PtdIns(4,5)P2 und PtdIns(3,4,5)P3 in den ektodermalen Epithelmuskelzellen nachgewiesen werden. Die etablierten Methoden können zukünftig weiterhin der detaillierten Untersuchung der Rho- GTPasen, sowie der PLC- und PI3- Kinase- Signalwege und deren Funktionen während morphogenetischer Prozesse in Hydra dienen. Zusätzlich konnte für das Relaxans Benzocain ein Protokoll zur effektiven und Aktinfaser- schonenden Immobilisierung und Relaxierung von Hydra erarbeitet werden. Dieses kann zukünftig zur in vivo Mikroskopie, aber beispielsweise auch als Relaxans zur mechanischen Manipulation, wie dem gezielten Einschneiden des Polypen zur Regeneration, genutzt werden.
Physical Description:243 Pages
DOI:https://doi.org/10.17192/z2020.0499