Philipps-Universität Marburg ths Prof. Dr. Hartmann Roland K., Hartmann, Roland K., (Prof. Dr.) https://doi.org/10.17192/z2020.0477 Artifizielle Ribonuklease doctoralThesis 176 application/pdf Inaktivierung von mRNAs und miRNAs durch DNA/LNA-basierte und mit zusätzlichen Funktionalitäten konjugierte Antisense-Oligonukleotide https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2020/0477/cover.png 2020 Since the discovery of RNA Interference (RNAi) in the late 90s, ongoing work and development of this genetic engineering tool has been executed in different biological and medical fields. This enabled the discovery of unknown protein functions and the development of RNA-Interference-based therapeutic agents. Usage of small non-coding RNAs, which can regulate the gene expression via RNAi, is one very promising therapeutic option, because microRNAs (miRNAs) possess a substantial influence on the regulation of countless biological processes such as differentiation, or cell proliferation. Therefore they can have tumour-suppressive as well as oncogenic properties. Besides innate miRNAs, small synthetic RNAs have been developed for therapeutical approaches and genetic analysis such as small interfering RNAs (siRNAs), enabling the usage of more stabilized and modified RNAs. The possibility of modification increased the areas of application for miRNAs and siRNAs as well as facilitating new therapeutic options. The first project of this thesis analysed the possibility of redirecting RISC to a specific mRNA via a bifunctional adapter oligonucleotide. This approach allows an inhibition of oncogenic miRNA function and a simultaneous suppression of a proto-oncogenic mRNA translation, which can lead to a synergistic antitumor effect. One adapter part is thereby directed against an oncogenic miRNA, which was loaded bevor into a RISC. The 3'-UTR of a specific mRNA is addressed by the second part of the adapter, which enables then the redirection of the indirect bound RISC to the addressed mRNA and thereafter inducing its degradation. At the beginning of this analysis the proto-oncogen PIM1 and the oncogenic miR-20a were addressed via the bifunctional adapter. Within in vitro studies it was shown that it is possible to bind and isolate miR-20a loaded RISCs from cell lysates. The bifunctional adapter effect was then examined in cell culture experiments, in which the protein expression of the proto-oncogene PIM1 and the tumour-suppressor P21, which is a target of miR-20a, was analysed. In observed cases the cell culture experiments showed a clear effect on the PIM1 expression, however this could not be reproduced stably. A change of the addressing miRNA part from miR-20a to the complete miR-17a family and then to the higher expressed let-7 miRNA family was also not able to stabilize the influence on the PIM1 and P21 expression. Nevertheless, the group of Michael Göbel was recently able to show a functional redirection of RISCs in in vitro assays. This indicates that in cell culture experiments more constant results are possible with a more stable mRNA system. The second topic of this thesis addressed the function of a metal-free synthetic nuclease-conjugate with a DNA/LNA mixmer-oligonucleotide and tris(2-aminobenzimidazole). Building up on very promising results from the Göbel group with DNA and PNA conjugates, in this thesis in vitro cleavage kinetics were done with a DNA/LNA mixmer conjugate. Those confirmed a clear reduction of the RNA substrate half-life compared to former analysed conjugates and furthermore a specific and efficient cleavage of longer RNA substrates with a length up to 412 nt. The cleavage position could be characterised and localized around the binding of the mixmer oligonucleotide with the addressed RNA substrate. The PIM1 mRNA was then addressed in subsequent cell culture experiments, in which occasional effects were observed, yet not reproducible. The promising in vitro results nevertheless indicate, that with further improvement of the cleavage kinetics, clear cell culture effects can be obtained. Fachbereich Pharmazie Pharmazeutische Chemie miRNA Pharmacology + therapeutics, prescription drugs Pharmakologie, Therapeutik opus:9253 2020-09-09 mRNA Thomas, Laura Thomas Laura Inactivation of mRNAs and miRNAs via DNA/LNA-based antisense oligonucleotide conjugates with additional functions Antisense-Oligonukleotid 2020-08-07 German Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg Universitätsbibliothek Marburg LNA Seit der Entdeckung der RNA Interferenz (RNAi) Ende der 90er Jahre wurde dieser Mechanismus als gentechnisches Werkzeug stetig weiterentwickelt und in den verschiedensten biologischen sowie medizinischen Bereichen eingesetzt. Dies ermöglichte nicht nur die Aufklärung unbekannter Gen-Funktionen durch Knockdown-Experimente, sondern auch die Entwicklung RNA-Interferenz-basierter Therapeutika. Hierbei stellt vor allem der Einsatz kurzer, nicht kodierender RNAs, welche die Genexpression mit Hilfe von RNAi beeinflussen können, eine vielversprechende Therapieoption dar. Sogenannte microRNAs (miRNAs) können einen wesentlichen Einfluss auf die Regulation unzähliger biologische Prozesse nehmen. Durch diese Beeinflussung, welche auch die Differenzierung und Proliferation von Zellen betreffen kann, können sie tumorsuppressive wie auch onkogene Eigenschaften besitzen. Neben den natürlich vorkommenden miRNAs wurde als Therapieansatz und zur gentechnischen Analyse ebenfalls synthetische kleine RNAs entwickelt, wie z.B. die small interfering RNAs (siRNAs). Dies ermöglichte es stabilere und modifizierte RNAs einzusetzen, was den Anwendungsbereich erweiterte sowie neue Therapiealternativen ermöglichte. Im ersten Projekt dieser Arbeit wurde untersucht, ob RISC-Komplexe an eine spezifische mRNA mit Hilfe eines bifunktionellen Adapter-Oligonukleotids umgeleitet werden können. Durch diesen Ansatz ist es möglich eine onkogene miRNA in ihrer Funktion zu inhibieren und gleichzeitig die Translation der mRNA eines Proto-Onkogens zu suppremieren und dadurch simultan einen synergistischen antitumorigenen Effekt zu erreichen. Dabei adressiert ein Teil des Adapters die onkogene miRNA, welche zuvor von einem RISC-Komplex gebunden wurde. Der zweite Adapter-Bereich ist gegen die 3'-UTR einer spezifischen mRNA adressiert und ermöglicht es so, den indirekt gebundenen RISC-Komplex zur mRNA umzuleiten und den Abbau dieser zu induzieren. Dieser Ansatz wurde zu Beginn der Untersuchungen bei dem Proto-Onkogen PIM1 und der onkogenen miR-20a, die die Proteinexpression des Zellzyklusregulators und Tumorsuppressors P21 herunterreguliert, analysiert. Es konnte mit Hilfe von in vitro Analysen gezeigt werden, dass mit miR-20a beladene RISC-Komplexe aus Zell-Lysaten eingefangen und isoliert werden können. In folgenden Zellkulturexperimenten wurde der Einfluss auf die Expression des Proto-Onkogens PIM1 und des Zellzyklusregulators P21 untersucht. Innerhalb der Zellkulturanalysen konnten Effekte auf die Expression der PIM1 Kinase festgestellt werden, was sich jedoch nicht eindeutig reproduzieren ließ. Auch nach einer Adressierungserweiterung der miR-20a zur kompletten miR-17 Familie sowie zur stärker exprimierten let-7 miRNA Familie, konnten keine stabilen Effekte in Zellkulturanalysen bei PIM1 sowie P21 festgestellt werden. Kürzlich konnte die Arbeitsgruppe von Michael Göbel jedoch in in vitro Experimenten bestätigen, dass beladene RISC-Komplexe mit Hilfe eines bifunktionalen Adapters zu einer spezifischen RNA umgeleitet werden können. Dies deutet darauf hin, dass es mit Hilfe eines stabileren mRNA Systems in Zukunft möglich ist, konstantere Ergebnisse in Zellkultur Experimenten zu erlangen. Ein Konjugat aus einem DNA/LNA Mixmer-Oligonukleotid und der synthetischen Nuklease Tris(2-aminobenzimidazol) wurde im zweiten Projekt dieser Arbeit untersucht. Aufbauend auf vielversprechende Ergebnisse mit entsprechenden DNA- sowie PNA-Konjugaten, welche in der Arbeitsgruppe von Michael Göbel erlangt werden konnten, wurden in dieser Arbeit zunächst in vitro Spaltkinetiken mit DNA/LNA Mixmer-Konjugaten durchgeführt. Diese bestätigten, dass der Wechsel zu DNA/LNA-Oligonukleotiden eine deutlich schnellere Spaltkinetik hervorbringt, wobei die Halbwertszeit der RNA-Substrate von 10 bis 20 Stunden auf 4 Stunden verkürzt werden konnte. Zudem spaltete das Nuklease-Konjugat RNA-Substrate von einer Länge von 412 Nukleotiden erfolgreich und spezifisch, was zuvor nur mit einer Substratlänge von 29 Nukleotiden gezeigt werden konnte. Die Spaltungsposition wurde ebenfalls charakterisiert und zeigt sich in unmittelbarer Nähe um die Bindung des Mixmer-Oligonukleotids mit dem adressierten RNA Substrat. Bei den durchgeführten Zellkulturanalysen wurde wie im ersten Projekt die mRNA der PIM1-Kinase adressiert, wobei vereinzelt Effekte beobachtet werden konnten, welche allerdings nicht reproduzierbar waren. Die vielversprechenden in vitro Ergebnisse indizieren jedoch, dass bei einer weiteren Verbesserung der Spaltkinetik, deutliche Effekte in Zellkulturanalysen erlangt werden können. PIM1 urn:nbn:de:hebis:04-z2020-04774 RISC 2020-09-09 monograph