An Experimental Framework to Examine the Influence of Promoter Architecture and Genomic Context on Gene Expression

Die Transkription ist ein grundlegender Prozess der Genexpression. Die in der DNA gespeicherten Informationen werden in mobile RNA transkribiert, die bei verschiedenen essenziellen Prozessen der Zelle, wie z.B. der Translation, eine Rolle spielen. Die Zellen benötigen jedoch nicht alle in der DNA gespeicherten Informationen gleichzeitig. Daher wird der Prozess der Transkription durch eine Vielzahl von Mechanismen reguliert. Ein häufig diskutierter, aber nicht vollständig verstandener Transkriptionsregulator ist das DNA Supercoiling [Travers and Muskhelishvili, 2005]. Wobei der Transkriptionsprozess selbst die DNA-Topologie vor und hinter der Transkriptionsmaschinerie beeinflusst, wie im twin supercoiling domain-Modell von Liu and Wang [1987] beschrieben. Dieses Phänomen wird als Transkriptions-gekoppeltes DNA-Supercoiling (TCDS) bezeichnet. Darüber hinaus reagieren die Gene individuell auf Veränderungen des DNA-Supercoilings und es besteht ein Selektionsdruck für Gene sich an die DNA-Supercoiling-Niveaus, welche durch das benachbarte Expressionsverhalten emittiert werden, anzupassen [Sobetzko, 2016]. Die Reaktionen der Promotoren auf Veränderungen im DNA-Supercoiling sind so vielfältig wie die Promotoren selbst. Insbesondere scheinen einige Promotoren nicht auf Änderungen im DNA-Supercoiling zu reagieren. Dies führt zu der Frage was die Vielfalt der Promotoren dazu bringt so unterschiedlich auf TCDS zu reagieren. Im Laufe dieser Arbeit wurde ein Versuchsprozess entwickelt, um die Auswirkungen von DNA-Supercoiling und TCDS auf Promotoren zu untersuchen. Zuerst wurde dafür eine Plasmid-Toolbox erstellt, die den modularen Aufbau von Transkriptionseinheiten ermöglicht. Das zentrale Merkmal dieser Toolbox ist die Flexibilität, verschiedene Anordnungen derselben Teile zu testen. Dies wurde erreicht, indem der gut etablierte MoClo-Standard adaptiert wurde und die Toolbox um diesen herum aufgebaut wurde. Dadurch wurde ein System geschaffen, welches eigenständig funktioniert, mit dem bestehenden MoClo-Standard kompatibel ist und ihn erweitert. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein Experimentaufbau entwickelt in welchem mit Hilfe von synthetischen σ70-Promotoren, der Einfluss von DNA-Supercoiling auf die Transkription untersucht werden kann. Der Versuchsaufbau ermöglichte präzise Veränderungen in Teilen des Promotors und schaffte gleichzeitig eine library dieser Promotoren. Mit Hilfe dieser Experimente zur Untersuchung der spacer-Region des Promotors konnte bestätigt werden, dass der spacer die Stärke des Promotors beeinflusst. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der spacer die Supercoiling-Empfindlichkeit nur geringfügig beeinflusst. Ferner konnte gezeigt werden, dass ein 5‘-TGTG-3‘-Motiv im spacer die Transkription durch eine verstärkte RNAP-Bindung senken könnte. Der Versuchsaufbau zeigte jedoch die Einschränkungen bei der Verwendung der DNA relaxierenden Chemikalie Novobiocin mit einem plasmid basierten System. Deshalb – und um die Auswirkungen von TCDS auf die benachbarte Transkription weiter zu untersuchen, wurde ein optogenetisch kontrollierbarer Promotor in den bereits etablierten Versuchsaufbau integriert. Schließlich wurden die ersten Schritte unternommen, um einen Weg zu finden, den Promoter-Test in jede beliebige genomische Stelle integrieren zu können. Dafür wurde ein auf CRISPR/Cas9 basierendes, homologes Rekombinationssystem weiterentwickelt und modularisiert, welches DNA-Fragmente nahtlos ins Genom integrieren kann.