Development of novel combined nano delivery system to improve cellular uptake of weakly basic anticancer drugs and cell imaging

Diese Promotionsarbeit beschäftigte sich mit der Herstellung verschiedener Nanomaterialien, einschließlich mesoporöser Silikananopartikel (MSNPs) und Liposomen, um daraus ein neuartiges Arzneistoffträgersystem zu entwickeln. Das sowohl hydrophile als auch lipophile Arzneistoffe zu Tumorzellen transportieren kann und dabei, im Hinblick auf die Arzneistoffe, eine Verbesserung der Biokompatibilität, eine höhere Effektivität und weniger Nebenwirkungen auf gesundes Gewebe aufweist. In der Einleitung wurde auf die Vorzüge und Nachteile der MSNPs als Nanoträgersysteme und in Kombination mit Lipidbeschichtungen näher eingegangen. Eine genauere Erklärung der Kombinationseffekte von Liposomen und MSNPs bei Retardträgersystemen oder stimuli-responsiven Trägersystemen unter Zuhilfenahme der Fachliteratur folgte. Das vorliegende Projekt lässt sich in vier Kapitel einteilen. Hier wurden die Trägersysteme eingehen charakterisiert und auf ihre Eigenschaften unter verschiedenen in-vitro Bedingungen, wie z.B. Normoxie und Hypoxie, eingegangen. Das erste Kapitel beschreibt die Herstellung der MSNPs unter Verwendung verschiedener Molmassenverhältnisse von Tensid zu Silika, zur Evaluation der die Partikelgrößenverteilung beeinflussenden Parameter. Als erste Charakterisierungs¬möglichkeit der physikochemischen Eigenschaften diente dabei die Messung der Partikelgröße mit Hilfe der Dynamischen Lichtstreuung (DLS) und die Messung der Oberflächenladung durch die Lader Doppler Velocimetrie (LDV). Die Entfernung des verwendeten Tensids, um die poröse Struktur zu erzeugten, wurde durch Elementaranalyse und Oberflächenladungsmessungen bestimmt. Die Untersuchung der Oberfläche der MSNPs erfolgte mit Hilfe der Messung von Sorption und Desorption von Stickstoff, dabei wurden die gemessene Fläche und das Volumen von der Extraktionszeit des Tensids beeinflusst. Verschiedene mikroskopische Techniken, wie die Raster-Kraft- und die Elektronenmikroskopie, dienten der Charakterisierung der Morphologie der Trägersysteme. Die Ergebnisse der Größenvermessungen nach Raster-Kraft-Mikroskopie waren dabei in Übereinstimmung zu den Ergebnissen der Größenmessung mit Hilfe der DLS. Unter Elektronenmikroskopen konnte außerdem die poröse Struktur der MSNPs beobachtet werden. Die Transmissions¬elektronenmikroskopie (TEM) zeigte, dass die MSNPs von mehr oder weniger runder Form waren und eine geordnete poröse Struktur aufwiesen. Die dabei gemessene Porengröße entsprach der Porengröße, die mit Hilfe der Sorptions-Desorptionsmethode bestimmt wurde. Zur genaueren Betrachtung der Porenstruktur und zur Vermessung der Porengröße und verteilung, kam außerdem ein Rastertransmissionselektronenmikroskop (STEM) zum Einsatz. Das zweite Kapitel beschreibt das Design und die Charakterisierung lipidüberzogener MSNPs als Trägersysteme. Kationische Liposomen, hergestellt mit Hilfe der Filmbildungsmethode, und mit ihnen überzogene MSNPs wurden dabei auf ihre hydrodynamischen Durchmesser, ihre Oberflächenladung und ihr FTIR-Spektrum untersucht. Die Lipidhülle der MSNPs konnte außerdem mit Hilfe von cryo-TEM- und TEM-Aufnahmen visualisiert werden. Die große Oberfläche der MSNPs und der daraus folgenden hohen Beladungskapazität für Arzneistoffe, macht sie zu einem interessanten Kandidaten für den Transport hoher Arzneistoffmengen. Die in-vitro Freisetzungskurve des Arzneistoffes Doxorubicin (Dox) zeigte eine verzögerte Abgabe des Arzneistoffes, wobei die Freisetzung aus nicht überzogenen Trägersystemen schneller war, als die aus den lipidüberzogenen. Daher konnte mit Hilfe des Lipidüberzuges das Problem der frühzeitigen, ungewollten Arzneistoffabgabe unter Lagerungsbedingungen gelöst werden. Eine vergleichende in-vitro Studie zur Zelltoxizität konnte zeigen, dass die lipidüberzogenen MSNPs aufgrund ihrer höheren Biokompatibilität höhere Doxorubicinkonzentrationen in die Zellen bringen konnten und daher einen stärkeren zytotoxischen Effekt als die nicht überzogenen MSNPs aufwiesen. Ein Nachweis dieses verstärkten Effektes erfolgte auch mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie. Hier zeigte sich eine stärkere Internalisation von Dox als klarer Hinweis auf eine stärkere Aufnahme der Trägersysteme in die Zellen. Im dritten Kapitel konnte ein stimuli-responsives Trägersystemen erfolgreich entwickelt werden. Dazu dienten lipidüberzogene MSNPs als Trägersysteme, Dox als Modellarzneistoff, Ultraschall (US) wurde als Stimulus verwendet und Perfluorpentan (PFP) war das auf den Stimulus reagierende Agens. Die Kombination von Liposomen und MSNPs ergab aufgrund der besonderen Struktur der MSNPs in Kombination mit der guten Biokompatibilität und dem Gatekeeping-Effekt der Liposomen sehr gute Ergebnisse. Der Einschluss von PFP in die Poren der MSNPs gelang durch Kapillarfüllung und es entstanden sehr stabile Nanoträgersysteme. Eine US-Behandlung mit von der FDA zugelassenen Spezifikationen löste eine sehr zufriedenstellende gezielte Freisetzung des Arzneistoffes aus. Dabei konnte ein Zerreißen der Lipidhülle, aufgrund des hohen Druckes der entstehenden Dämpfe des PFP innerhalb der Poren der MSNPs, beobachtet werden. Die durchgeführten in-vitro Zellkulturversuche konnten eine höhere Aufnahme aufgrund besserer Biokompatibilität bei den lipidüberzogenen Trägersystemen und einen stärkeren zytotoxischen Effekt nach gezielter Freisetzung des Arzneistoffes durch US nachweisen. Diese intelligenten Nanoträgersysteme sind für viele Chemotherapeutika einsetzbar und sorgen durch ihre gezielte Freigabe des Arzneistoffes direkt im betroffenen Gewebe für besser Effektivität des Arzneistoffes und geringe unerwünschte Nebeneffekte auf gesundes Gewebe. Die Basis des vierten Kapitels dieser Studie war die Entwicklung eines Trägersystems für den kombinierten Transport von Doxorubicin und eines Inhibitors der Carbonischen Anhydrase IX. Dabei wurde der Inhibitor in den Lipidfilm der Liposomen eingeschlossen, die als Überzug für mit Doxorubicin beladene MSNPs dienten. In-vitro Untersuchungen zur Zelltoxizität wurden unter Normoxie und Hypoxie durchgeführt. Dabei wurde auch nachgewiesen, dass das Enzym Carbonische Anhydrase IX unter hypoxischen Bedingungen überexprimiert wird, sodass der Inhibitor effektive Ergebnisse erzielen kann, da er nur bei überexprimiertem Enzym seinen Effekt entfaltet. Auch konnte eine synergistische Kombination von Dox und dem Inhibitor der carbonischen Anhydrase IX unter hypoxischen Bedingungen dargestellt werden. Höhere Inhibitionseffekte gegen die Carbonische Anhydrase IX wiesen inhibitorbeladene Liposomen im Vergleich zu freiem Inhibitor auf. Diese Ergebnisse sind allerdings noch in einem initialen Stadium und bedürfen daher einer weiteren Prüfung. Für zukünftige Studien ist es das Ziel eine in-vivo Evaluation des Trägersystems vorzunehmen. Dabei soll die Biodistribution des Trägersystems und des Arzneistoffes in den verschiedenen Organen untersucht werden. Die gezielte Freisetzung nach Stimulation durch US wird auch in in-vivo Tierversuchen geprüft. Im Bereich der MSNPs ist es das Ziel diese als Trägersysteme für andere Arzneistoffe wie zum Beispiel Photosensitizer zu entwickeln. Somit kann ein stimuli-responsives Trägersystem aufgebaut werden, bei dem die Arzneistofffreisetzung durch US und die Arzneistoffaktivierung und damit der zelltoxische Effekt durch Licht gesteuert werden kann. Eine Weiterführung der Experimente zur Hypoxie, die sich noch in einem sehr frühen Stadium befinden, sind ebenso geplant, wie weitere Untersuchungen unter hypoxischen Bedingungen für die Evaluation des photodynamischen Effektes bei Sauerstoffmangel.