The stress-protectants and chemical chaperones ectoine and hydroxyectoine: enzymes, importer, exporter and transcriptional regulation

Fluktuationen des extrazellulären osmotischen Potentials zählen zu den häufigsten Stressfaktoren für Mikroorganismen. Nicht nur zahlreiche Organismen der Domäne Bacteria, sondern auch einige Archeen und wenige einzellige, halophile Eukaryoten besitzen die genetische Information zur Synthese der kompatiblen Solute und chemischen Chaperone, Ectoin und 5-Hydroxyectoin. Unter hochosmolaren Bedingungen werden diese Substanzen innerhalb des Zytoplasmas angehäuft, um den Ausstrom des Wassers entlang des Konzentrationsgradienten zu verhindern und somit, den essentiellen Turgordruck innerhalb der Zelle aufrecht zu erhalten. Ectoine erfüllen nicht nur wichtige Schutzfunktion für Mikroorganismen, sie besitzen darüber hinaus nützliche physikalisch-chemische und funktions-erhaltende Eigenschaften. Diese Attribute führten zur industriellen Produktion und kommerziellen Verwendung von Ectoinen. Die drei Enzyme EctB (L-2,4-Diaminobutyrat Aminotransferase), EctA (L-2,4-Diaminobutyrat Acetyltransferase) und das Schlüsselenzym EctC (Ectoin Synthase) sind für die Biosynthese von Ectoin aus dem Vorläufer L-Aspartat-β-Semialdehyd verantwortlich. Zusätzlich kann durch die Ectoin Hydroxylase (EctD) eine Hydroxylgruppe eingeführt werden, was zur Entstehung von 5-Hydroxyectoin führt. Die Gene des Ectoin-Biosynthesewegs sind meist in einem Operon kodiert [ectABC(D)], das durch einen osmotisch-induzierbaren Promotor gesteuert wird. Neben der de novo Synthese von Ectoinen, besitzen die meisten Mikroorganismen spezielle Osmolyttransporter, die deren Aufnahme aus der Umwelt ermöglichen. Im Rahmen dieser Dissertation wurden folgende Bereiche untersucht und Ergebnisse erhalten: • Bioinformatische Analysen zur phylogenetischen Verbreitung von Ectoin- Biosynthesegenen und Untersuchung der Genomumgebungen von ect Clustern • Strukturelle und funktionelle Analyse von Enzymen des Ectoin-Biosynthese-Wegs o Kristallographische, biochemische und funktionelle Analyse des Schlüsselenzyms EctC führten zur Postulierung des Reaktionsmechanismus o Die Substratpromiskuität der Ectoin-Hydroxylase (EctD) ermöglichte die stereo- und regio-selektive Hydroxylierung des synthetischen Ectoin-Derivats Homoectoin • Etablierung von Ectoin/5-Hydroxyectoin-produzierenden Zellfabriken o Die Sekretion der Produkte erfolgt unabhängig von mechanosensitiven Kanälen und den Aufnahmesystemen für Ectoine im heterologen Produzenten E. coli • Regulation der Ectoine-Biosynthese-Gene o Detaillierte molekulare und funktionelle Analyse des ect Promotor aus P. stutzeri A1501 identifizierten einen untypischen Sigma-70-abhängigen Promotor und lieferte neue Einblicke in die Determinanten für die osmotische Regulation der ect Gene o Bioinformatische, kristallographische und funktionelle Analyse des MarR-typ Regulators EctR aus Novosphingobium • Untersuchung von Transportern in der Genomumgebung von Ectoin-Biosynthese- Clustern o Co-Transkription neuer Transporter und mechanosensitiver Kanäle o Charakterisierung zwei neuer Ectoin-Transportern mit breitem Substratspektrum (EctI) und hoher Spezifität für Ectoine (EctU) o Funktionelle Analyse von mechanosensitiven Kanälen, die in ect Genclustern kodiert sind o Identifizierung und Charakterisierung eines spezifischen Exporters für Ectoine (EctE)