Molecular biological and biochemical approaches to expand the spectrum of fungal natural products

At least 3.5 billion years ago, the first life on earth arose. This was the starting point of the evolutionary development of numerous living beings. According to current estimations, there are 1012 different species on our planet. Most of this enormous biodiversity originates from the kingdom of...

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Main Author: Kindinger, Florian
Contributors: Li, Shu-Ming (Prof. Dr. ) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2019
Pharmazeutische Biologie
Subjects:
PKS
Online Access:PDF Full Text
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Table of Contents: Vor mindestens 3,5 Milliarden Jahren entstand das erste Leben auf der Erde. Dies war der Startpunkt der evolutionären Entwicklung zahlreicher Lebewesen. Nach aktuellen Schätzungen existieren 1012 verschiedene Arten auf unserem Planeten. Der überwiegende Anteil dieser enormen Artenvielfalt stammt aus dem Reich der Bakterien und Archaeen. Basierend auf dieser Schätzung sind bis zum heutigen Tag gerade einmal 0,001 % aller Arten bekannt. Die allgegenwärtige Konkurrenz zwischen den Lebewesen führte unter anderem zu der Entwicklung des Sekundärstoffwechsels. Die aus diesem Stoffwechsel stammenden Sekundärmetabolite sind nicht essenziell für das Überleben, dennoch bietet deren Produktion dem Organismus zahlreiche Selektionsvorteile. Pflanzen, Bakterien und Pilze gehören zu den Hauptproduzenten von Sekundärmetaboliten. Die über 2.140.000 Millionen bekannten Sekundärmetabolite lassen sich in fünf große Gruppen einteilen: (1) nicht-ribosomale Polypeptide, (2) Polyketide, (3) Alkaloide, (4) Terpenoide und Steroide und (5) Enzymkofaktoren. Viele dieser Naturstoffe weißen eine biologische bzw. pharmazeutische Aktivität auf und dienten zur Entwicklung von Arzneimitteln. Die große Anzahl bisher nicht identifizierter Mikroorganismen beherbergt ein gewaltiges ungenutztes genetisches Potential zur Produktion weiterer neuer Naturstoffe. Solche Stoffe können sich zur Entwicklung dringend gebrauchter neuer Arzneimittel eignen. Verschiedene Ansätze, wie z.B. die heterologe Expression in geeigneten Wirtsorganismen werden verfolgt, um dieses Potential zugänglich zu machen. Des Weiteren können durch Ansätze der synthetischen Biologie die Diversität der Naturstoffe erweitert werden und so neue Naturstoffe entdeckt bzw. produziert werden. Im Rahmen der Forschung an Sekundärmetaboliten beschäftigt sich diese Arbeit mit drei thematischen Schwerpunkten: 1. Die Erweiterung des Spektrums möglicher Substrate für Prenyltransferasen mittels einer Datenbank zur Vorhersage neuer Substrate. 2. Die Identifizierung und Charakterisierung bisher unbekannter Biosynthesegencluster, sowie die Untersuchung einer möglichen Anwendung der beteiligten Enzyme für die Produktion neuer Naturstoffe. 3. Die Generierung eines Stamms für die heterologe Expression von Sekundärmetabolitgenen und die Untersuchung ihrer unbekannten Produkte. Prenyltransferasen katalysieren den Transfer von Prenyleinheiten (n × C5) auf ihre Zielsubstrate. Dies ist von besonderer Bedeutung, da bei zahlreichen Verbindungen eine Zunahme der biologischen Aktivität von prenylierten Verbindungen im Vergleich zu ihren nicht prenylierten Vorstufen beobachtet wurde. Eine besondere Eigenschaft von Prenyltransferasen ist ihre Promiskuität bezüglich der von ihnen akzeptierten Substrate. Dies macht sie zu geeigneten Kandidaten für die Produktion pharmazeutisch wirksamer Substanzen. Jedoch gestaltet es sich in der Praxis schwierig neue passende Substrate für Prenyltransferasen zu identifizieren. Um dieses Problem anzugehen, wurde im Rahmen dieser Studie eine Datenbank, PrenDB, für die Vorhersage solcher Substrate entwickelt. Die Vorhersagekraft dieser Datenbank wurde anschließend mit 38 vorhergesagten Substraten und deren Akzeptanz durch die Prenyltransferasen FtmPT1, FgapT2 und CdpNPT experimentell überprüft. Bei 27 der 38 Substrate konnte eine Prenylierung von mindestens einem der drei getesteten Enzymen beobachtet werden. Des Weiteren zeigten 17 Substrate mit mindestens einer Prenyltransferase Umsatzrate von mehr als 50 %. Dies belegt die Vorhersagekraft der entwickelten Datenbank und ermöglicht so die zielgerichtete Auswahl neuer potenzieller Substrate und Identifizierung neuer Substratklassen. Die Identifizierung von Biosynthesegenclustern und die anschließende biochemische Charakterisierung der an der Biosynthese beteiligten Enzyme bildet die Grundlage für die Ansätze der synthetischen Biologie zur Produktion von Naturstoffen. Anhand von dem cyclischen Dipeptid Echinulin wurde in dieser Arbeit ein mögliches Vorgehen zur Identifizierung des verantwortlichen Genclusters und die Verwendung der beteiligten Enzyme zur Biosynthese neuer Substanzen beschrieben. Basierend auf den strukturellen Eigenschaften von Echinulin wurde die enzymatischen Voraussetzungen für dessen Biosynthese ermittelt. Ein Gencluster dafür muss demnach Gene für eine nichtribosomalen Peptidsynthetase und mehrere Prenyltransferasen enthalten. Im Genom des Echinulin-Produzenten Aspergillus ruber konnte ein Gencluster mit diesen Vorrausetzungen identifiziert werden. Enzymtests mit der Echinulin-Vorstufe cyclo-L-Tryptophanyl-L-Alaninyl und den heterolog produzierten Prenyltransferasen EchPT1 und EchPT2 führten zu einer fundierte Biosynthesehypothese und bestätigten die Beteiligung des Genclusters an der Biosynthese von Echinulin. Das Zusammenwirken von EchPT1 und EchPT2 mit cyclo-L-Tryptophanyl-L-Alaninyl als Substrat führte zu Bildung von insgesamt 7 Produkten mit unterschiedlicher Anzahl an Prenylierungen. Diese besondere Eigenschaft wurde anschließend genutzt um weitere zyklische Dipeptide mehrfach zu prenylieren. Hierfür wurden die Stereoisomere von cyclo-Tryptophanyl-Alaninyl und cyclo- Tryptophanyl-Prolinyl verwendet. Analog zur Biosynthese von Echinulin führte dies zur Bildung von an Position C2, C5 und C7 dreifach-prenylierten Hauptprodukten, sowie weiteren zweifach-, dreifach- und vierfach-prenylierten Nebenprodukten. Eine weitere Möglichkeit Sekundärmetabolite zu produzieren und zu untersuchen ist die heterologe Expression in einem geeigneten Stamm. Ein potenzieller neuer Stamm für die heterologe Expression, Penicillium crustosum, wurde in dieser Arbeit untersucht. Dafür wurde das Genom des Pilzes sequenziert und durch Deletions- und Expressionsexperimente die Beteiligung der Polyketidsynthase Pcr4401 an der Biosynthese der Melaninvorstufe YWA1 bestätigt. Die erfolgreiche Integration von fremden Genen in den pcr4401 Genlokus lässt sich durch das Auftreten eines Albinophänotyps leicht erkennen. Zur besseren Verwendung als Expressionsstamm wurde ein pyrG defizienter Mutant und zwei Plasmide zur Integration fremder Gene in den pcr4401 Genelokus generiert. Die Eignung als Expressionswirt wurde anschließend durch die erfolgreiche Expression von drei PKS Genen und die Strukturaufklärung der gebildeten Produkte verifiziert.