Advanced Colloidal Systems for Targeted Chemotherapy

Die aktuelle Projektarbeit gibt einen detaillierten Einblick in die Oberflächenmodifikation verschiedener fortgeschrittener kolloidaler Systeme sowie in deren In-vitro- und In-vivo-Targeting-Fähigkeiten. Drei verschiedene kolloidale Systeme (Nanopartikel, Mikropartikel und Liposomen) wurden auf ihre Wirksamkeit und Konsistenz der Ergebnisse untersucht. In der Einleitung wird ein Überblick zum passiven und aktiven Targeting von Chemotherapeutika mit unterschiedlichen Kolloidsystemen gegeben. Verschiedene Methoden zur Herstellung und Charakterisierung dieser kolloidalen Systeme werden besprochen. Dies bildete denAusgangspunkt für die Verwendung dieser Formulierungen im Promotionsprojekt. Darüber hinaus wurde eine kurze Einführung über Aptamere und verschiedene Beispiele für Targeting-Moleküle gegeben, um die selektiven Bindungseigenschaften der Aptamere zu erläutern. Dies lieferte die Grundlage für die Oberflächenmodifizierung kolloidaler Formulierungen mit dem interessierenden Aptamer. Sorafenib-Tosylat (SFB) wurde als Chemotherapeutikum ausgewählt. Der Grund hierfür war die niedrige Löslichkeit und Bioverfügbarkeit mit einem LogP Wert von 4,54 und der Biopharmazeutischen Klassifikation von IV. Des Weiteren zeigt SFB aufgrund nicht-spezifischer Wechselwirkungen eine systemische Toxizität. Ein weiteres Problem, das bei Verwendung dieses Chemotherapeutikums entsteht, ist die Entwicklung einer Wirkstoffresistenznach mehrmaliger Applikation. Daher sollte die aktuelle Studie die Wirksamkeit der Krebstherapie unter Verwendung von mit SFB-beladenen kolloidalen Systemen in Kombination mit Anti-ErbB3-Aptamer (Apt) verbessern. Der erste Teil des Ergebnisses und der Diskussion umfasste die Charakterisierung von SFB-beladenen PLGA-Matrixsystemen, d. h. Nanopartikeln und Mikropartikeln. Die Daten zu Einkapselungseffizienzen zeigten eine erfolgreiche Beladung der Trägersysteme mit SFB. Die physikalisch-chemische Untersuchung mittels Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie, Elementaranalyse und Fluoreszenzanalyse bestätigte die Oberflächenmodifikation dieser Systeme mit Apt. Darüber hinaus stützten morphologische Analysen mittels Atomkraft- und Rasterelektronenmikroskopie diese Ergebnisse und zeigten ein optimales Oberflächenrauheitsprofil für Zelloberflächenwechselwirkungen. Zellkulturstudien verdeutlichten einen positiven Einfluss der Kombination von SFB und Apt. Das Vorhandensein von SFB und Apt zusammen zeigte maximale Zytotoxizitäten im Vergleich zu anderen Formulierungen. Dosisabhängige Toxizitäten wurden unter Verwendung des Zelllebensfähigkeitstests nachgewiesen. Darüber hinaus ist die zeitabhängige Abgabe der Formulierung an das Zytoplasma und anschließend an die Kernmembran mit Hilfe der CLSM-Visualisierung beobachtet worden. In Gegenwart von SFB und Apt konnte im Vergleich zu Kontrollpräparaten eine höhere Produktion reaktiver Sauerstoffspezies beobachtet werden. Das Aptamer allein induzierte jedoch keine signifikante ROS-Produktion. Bei Behandlung der Zellen mit unterschiedlicher Partikelkonzentration wurde eine signifikante dosisabhängige ROS-Produktion festgestellt. Die metastatische Hemmung durch die Partikel, insbesondere die mit SFB und Apt, wurde aus dem Kratztest ersichtlich. Das Fehlen von SFB und Apt führte zu einer vollständigen Wundheilung innerhalb von 24 Std. Ex-vivo-Hämolysestudien zeigten die Hämokompatibilität der PLGA-Matrices und verdeutlichten die In-vivo-Sicherheit dieser Formulierungen. Das Vorhandensein von SFB sowie Apt änderte das hämolytische Potential der Formulierungen nicht wesentlich. Alle Formulierungen weisen eine höhere Hämokompatibiltät im Vergleich zu SFB auf. Der RBC-Aggregationstest wies keinemorphologische Veränderung von RBCs auf. Die In-vivo-Auswertung der Blutprofile sowie die Serumbiochemie bestätigten die Sicherheit der Formulierung. Trotzdem kam es in Gegenwart von SFB und Apt zu herz- und leberspezifischen Toxizitäten, jedoch war der viszerale Index des gesamten Körpers normal. Ergebnisse und Diskussion umfassten die Charakterisierung von SFB-beladenen Liposomen. Die physikalisch-chemische Untersuchung der Liposomen mittels dynamischer Lichtstreuung und Laser-Doppler-Velocimetrie ergab eine nahezu monomodalen Größenverteilung von 121 nm bis 155 nm, der für die Internalisierung von Zellen geeignet ist. Das Vorhandensein von SFB und Apt beeinflusste jedoch die hydrodynamischen Durchmesser und Zeta-Potentiale der Formulierungen. Darüber hinaus wurden morphologische Eigenschaften durch Rasterkraftmikroskopie untersucht und zeigten optimale Größen und Oberflächenrauheitsprofile für Zelloberflächenwechselwirkungen. Synergistische dosisabhängige Zytotoxizitäten wurden unter Verwendung von SFB und Apt in Liposomen in 2D-Zellkulturtechniken gezeigt. Die Bewertung der Toxizität wurde auch in 3D-Zellkulturen durchgeführt und resultierte in einer Flächenverkleinerung der 3D Kulturen. Dieser Effekt wurde auch im Apoptose-Assay deutlich, der die Kernkondensation als möglichen Mechanismus für den Zelltod zeigte. Das Vorhandensein von oberflächenmodifizierten Liposomen in Zellen ist unter Verwendung von CLSM sichtbar gemacht worden. Diese Untersuchungen zeigten das Vorhandensein von Liposomen in der Zelle, insbesondere in der Nähe der Kernregion (Co-Lokalisierungskoeffizient; 0,4-0,7). Zur Bestimmung der In-vivo-Sicherheit sowie des Transfektionspotentials von oberflächenmodifizierten Liposomen wurde das Chorioallantoismembranmodell (CAM) herangezogen. CLSM Studien zeigten das Vorhandensein der Formulierungen im Mesoderm des CAM und esgab keine Hinweise auf eine Toxizität während der Embryonalentwicklung. Studien bezüglich der Hämokompatibilität der Formulierungen bestätigten die Sicherheit im Vergleich zuSFB. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine kolloidale Formulierung bestehend aus einer Kombination von Chemotherapeutikum und Aptamerein leistungsstarkes Medikament in der Krebstherapie darstellt. Durch die Anwesenheit von Aptamer wird ebenso das Nebenwirkungspotential erheblich reduziert, da sich die Formulierungen spezifisch bei resistenten Tumoren akkumulieren und die Wirkstoffe freigeben.