Characterization of DNA interference by a minimal Type I-F CRISPR-Cas system

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) und CRISPR-assoziierte (Cas) Proteine stellen das einzige in Bakterien und Archaeen bekannte adaptive Immunsystem dar. Hierbei kann ein Organismus mit Hilfe von Ribonukleoproteinkomplexen, die mit kleinen CRISPR RNAs (crRNAs) ausgestattet sind, fremde Nukleinsäuren erkennen und degradieren. Dieser Vorgang wird als Interferenz bezeichnet. CRISPR-Cas Systeme werden in sechs verschiedene Typen klassifiziert. Die Systeme des Typs I sind in der Natur am weitesten verbreitet; sie bestehen aus sieben Untertypen (A-F, U) und ihr gemeinsames Erkennungsmerkmal ist die Ziel-DNA Helikase/Nuklease Cas3. Alle Typ I-Systeme führen Interferenz mit Hilfe eines Ribonukleoproteinkomplexes (genannt CRISPR associated complex for antiviral defence, Cascade) aus, welcher aus mehreren Cas-Proteinen sowie einer einzigen crRNA besteht. Die Cascade-Komplexe können hierbei zwischen eigenen und fremden Nukleinsäuren unterscheiden, indem sie die PAM (Protospacer Adjacent Motif) identifizieren. Dabei handelt es sich um eine kurze, neben dem Protospacer liegende Sequenz, die wiederum neben der zur crRNA komplementären Region liegt. In Systemen des Typs I-F wird die Erkennung der PAM von der großen Untereinheit Cas8f ausgeführt. Die vorliegende Arbeit analysiert eine minimale Variante des Typ I-F CRISPR-Cas Systems, die in Shewanella putrefaciens CN-32 entdeckt wurde. Während dieser minimalen Variante die große Untereinheit fehlt, enthält sie zwei zuvor unbekannte Cas-Proteine, die in einer vorangehenden Arbeit als funktionelle Homologe von Cas5 und Cas7 identifiziert wurden. Der minimale Cascade-Komplex wurde in Escherichia coli BL21 AI exprimiert. Seine Interferenz-Aktivität sowohl gegen Bakteriophagen als auch gegen Plasmide konnte als sequenz-, PAM- und Cas3-abhängig nachgewiesen werden. Dies beweist, dass für die Interferenz weder die Cas8-Untereinheit, noch andere Proteine aus S. putrefaciens notwendig sind. Durch strukturelle Analysen konnte des Weiteren eine alpha-helikale Domäne des Cascade-Proteins Cas5fv identifiziert werden, welche für die Erkennung der GG PAM aufseiten der großen Furche verantwortlich ist, sowie die Stabilisierung des Nicht-Ziel-Stranges durch Cas7fv-Untereinheiten. Außerdem wurde die Bindungskinetik des Komplexes mit Hilfe von BioLayer Interferometry (BLI) bestimmt. Dies gewährt uns Einsicht in die strukturellen Anforderungen, die der Cascade-Komplex an seine Substrate stellt. Weiterhin wurde Single-Particle Tracking Photo-Activated Localization Microscopy (sptPALM) verwendet, womit eine unspezifische DNA-Bindungskapazität der alpha-helikalen Domäne von Cas5fv aufgedeckt werden konnte, sowie die Fähigkeit von Cas5fv und Cas6f mit RNA zu interagieren. Bei den Cascade-Komplexen wurden die Bindungszeiten an genomische Ziele bestimmt, die sich direkt proportional zur Komplementarität von crRNA und DNA verhielten. Vollständig komplementäre Ziele lösten eine Bindung von 15 Sekunden aus. Wir schlagen vor, dass dieser minimale Cascade-Komplex eine evolutionäre Antwort auf das Entstehen von viralen Anti-CRISPR-Proteinen (Acr-Proteine) ist. Dies sind kleine Proteine, welche die CRISPR-Cas Interferenz auf verschiedenen Wegen blockieren können. Die Wirkung des vielseitigen Acr-Proteins AcrF9 auf den minimalen Komplex wurde untersucht und es konnte weder eine Abnahme der Interferenz, noch eine anderweitige physikalische Interaktion gezeigt werden. Dies bestätigt die Annahme, dass selektiver Druck durch die Entstehung der Acr-Proteine eine Reduzierung der Cascade-Komplexe zur Folge hat.