Construction of Enzymes with Synthetic Allosteric Regulation to Control Metabolic Pathways of Escherichia coli

In Metabolic Engineering werden Stämme generiert, die bestimmte Stoffwechselprodukte überproduzieren. Dazu werden bestehende Stoffwechselwege von jeglicher transkriptioneller, translationeller und post-transkriptioneller Regulation befreit, was dazu führt, dass beteiligte Enzyme in hoher Anzahl vorliegen und unabhängig der Konzentration des Endprodukts aktiv sind. Eine komplette Deregulation eines Stoffwechselweges ist allerdings auch problematisch: Eine Reaktion auf interne oder externe Störungen ist häufig nicht möglich und der Gesamtmetabolismus überfordert mit der Überproduktion eines bestimmten Metaboliten, was dazu führt, dass die zelluläre Fitness reduziert wird und Wachstumsraten abnehmen. Um dieses Problem zu lösen, kann es hilfreich sein, neue Regulationsmechanismen in das metabolische Netzwerk und im Besonderen in den Überproduktions-Stoffwechselweg einzuführen. Bisher wurde dazu in der Regel vor allem die Enzymproduktion neu reguliert. Ein Beispiel dafür sind Zwei-Phasen-Bioprozesse, welche unterteilt sind in eine Wachstumsphase, in der ausreichend Biomasse akkumuliert wird, und eine Produktionsphase, in welcher die für die Überproduktion benötigten Enzyme hergestellt und gegebenenfalls Flüsse in konkurrierende Stoffwechselwege blockiert werden. Allerdings erlaubt eine Regulation der Enzymmenge keine schnelle Regulation innerhalb von Sekunden oder Minuten, was insbesondere in großen Bioreaktoren wichtig wäre, da unzureichende Vermischungen hier dazu führen, dass die Verfügbarkeit von Nährstoffen und Sauerstoff sehr stark schwanken kann. Dies kann zur Bildung von Bereichen innerhalb des Bioreaktors mit nur geringer Nährstoffversorgung, so genannter dead zones, führen. Zellen, in denen der Überproduktions-Stoffwechselweg dereguliert oder lediglich die Enzymmenge gesteuert wird, sind nicht in der Lage sich kurzfristig auf sich ändernde Umweltbedingungen zu reagieren, mit der Folge, dass solche Zellen in dead zones stärker gestresst werden und damit die Produktivität des gesamten Bioprozesses abnimmt. Eine schnellere und dynamische Kontrolle der Stoffwechselwege, beispielsweise durch synthetische allosterische Regulation eines an der Überproduktion beteiligten Enzyms könnte daher hilfreich sein. Allerdings ist die Konstruktion und Nutzung eines solchen Enzyms kompliziert. Ein wichtiges Ziel dieser Arbeit war deren Konstruktion und Überprüfung, ob mit diesen Flüsse abhängig des gewünschten Effektors kontrolliert werden können. Da synthetische allosterische Enzyme als eine Art „Metabolisches Ventil“ in den von ihnen katalysierten Reaktionen agieren und wir diese in vivo charakterisieren wollen, war unser erstes Ziel das Schalten von metabolischen Ventilen an Engpässen im Stoffwechsel (sogenannte Metabolic Bottlenecks) zu untersuchen (Kapitel 3). Dazu haben wir das Wachstum und metabolische Profile von Wildtypisolaten und Laborstämmen analysiert und konnten zeigen, dass in Laborstämmen ein zuvor beschriebenes Bottleneck in der Pyrimidin-Biosynthese (verursacht durch zu geringe pyrE-Expressionsraten), dafür sorgt, dass der Fluss in den Stoffwechselweg so gering ist, dass letztlich sogar die Wachstumsrate verringert ist. Zusätzlich dazu haben wir CRISPR interference verwendet um 30 künstliche Bottlenecks in unterschiedliche Teile des metabolischen Netzwerks einzubringen. In 16 dieser Stämme mit einem solchen Bottleneck konnten wir erhöhte Substrat- und/oder reduzierte Produktkonzentrationen feststellen, die auf ein erfolgreich eingefügtes Bottleneck hindeuten. Allerdings konnten wir nur in 6 dieser 16 Stämme auch eine reduzierte Wachstumsrate feststellen, was unterstreicht, dass der Einfluss metabolischer Bottlenecks auf die zelluläre Fitness von der Stärke des Bottlenecks sowie der Reaktion, in die das Bottleneck eingeführt wurde, abhängig ist. Im zweiten Teil haben wir dann zwei Methoden evaluiert, mit denen synthetische allosterische Enzyme konstruiert werden können und welche beide auf dem Konzept der gerichteten Evolution basieren, nämlich „Split Proteins“ (Kapitel 4) und „Domain Insertion“ (Kapitel 5). Mit Hilfe des Split Protein-Ansatzes waren wir in der Lage, zwei Fragmente der Dihydrofolatreduktase (DHFR) mit den konditionell interagierenden Proteinen FRAP und FKBP12 zu verbinden, resultierend in einem Rapamycin-abhängigen metabolischem Enzym, das zur Kontrolle des Folat-Biosynthese und letztlich der Wachstumsrate genutzt werden kann. Mit dem Domain Insertion-Ansatzes konnten wir Chimere aus metabolischen Enzymen – 2-isopropylmalate-Synthase (LeuA) bzw. DHFR – und dem Maltose-bindenden Protein MBP als regulatorischer Domäne bilden. Wir waren in der Lage funktionelle Proteine zu identifizieren, die ausreichend katalytische Aktivität haben um Deletionsmutanten zu komplementieren. Allerdings konnten is jetzt keine Varianten gefunden werden, die sensitiv zum Effektor Maltose sind. Das Domain Insertion-Protokoll haben wir dahingehend optimiert, dass nun Stammbibliotheken, bestehend aus tausenden Stämmen, die potentiell Maltose-abhängige Enzymvarianten exprimieren können, hergestellt werden können, sodass eine Hochdurchsatzmethode zur Identifikation der interessanten Stämme benötigt wurde. Im dritten Teil haben wir daher das Fluoreszenzprotein TIMER, das als Einzelzell-Wachstumssensor verwendet werden kann, für seine Verwendung in E. coli und im Besonderen zur Anreicherung langsam wachsender Zellen aus einer großen Stammbibliothek evaluiert (Kapitel 6). Die darauf aufbauende Anreicherungsmethode soll in Zukunft dafür verwendet werden, Stämme mit Enzymvarianten, die mit Domain Insertion hergestellt wurden und in welche synthetische allosterische Regulation erfolgreich implementiert wurde, zu identifizieren und anzureichern.