Bifunctionality: New Insights into the Class of (6-4)Photolyases and animal-like Cryptochromes

Die Familie der Cryptochrome und Photolyasen (CPF) ist eine große Proteinfamilie von Blaulicht Photorezeptoren, welche in allen Bereichen des Lebens vertreten sind. Alle Vertreter dieser Familie verwenden einen Flavinchromophor als katalytischen Kofaktor und zeigen hohe Sequenz- und Strukturähnlichkeiten, obwohl sich ihre Funktionen in lebenden Organismen stark unterscheiden. Einerseits verwenden Photolyasen die Energie des Sonnenlichts zur Reparatur von UV-induzierten DNA Schäden wie dem Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer (CPD) Schaden oder dem Pyrimidin-(6-4)-Pyrimidon Photoprodukt ((6 4)PP). Cryptochrome sind andererseits involviert in verschiedenen Blaulicht-regulierten Mechanismen, wie zum Beispiel die photoperiodischen Blühzeiten in Pflanzen oder die Regulierung des circadianen Rhythmus in Tieren. Diese Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung der Photoreduktion sowie des (6 4) Reparaturmechanismus einer Untergruppe von tierischen Cryptochromen und (6 4) Photolyasen anhand des animal-like Cryptochromes aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii (CraCRY). Durch multiple Sequenzvergleiche mit anderen CPFs und Mutationsstudien konnten die spezifischen und für die Photoreduktion relevanten Aminosäure-Reste identifiziert werden. Dies führte zur Entdeckung eines Tyrosins als vierten Elektronendonor am Ende der konservierten Tryptophantriade. Die Photoreduktion wurde weiterhin mit verschiedenen spektroskopischen Methoden untersucht mit besonderem Augenmerk auf der Entstehung und den Abbau des Tyrosylradikals. Wie gezeigte wurde, handelt es sich bei CraCRY nicht nur um ein Cryptochrom, sondern es zeigt darüber hinaus (6-4)-Photolyase Aktivität, was es zu einem bifunktionellen Mitglied der CPF macht. Um die Beziehung zwischen Struktur und Funktion zu untersuchen, habe ich die 3D-Struktur von CraCRY im Komplex mit seinen Chromophoren sowie einem (6-4)PP per Röntgenstrukturanalyse entschlüsselt. Dabei zeigte sich ein neuer Modus für die DNA Bindung sowie ein detaillierter Einblick in die aktive Tasche. Ein essentieller Rest für die DNA Reparatur (His1) wies eine veränderte Konformation im Vergleich zu dem bisher veröffentlichen Model auf. Dies könnte auf einen alternativen Reparaturprozess für (6-4)PP hindeuten. Die wissenschaftlichen Erkenntnisse über die Struktur von Cryptochromen basieren vor allem auf dem Vergleich zu Photolyasen, jedoch besitzen Cryptochrome einen elongierten C-Terminus (CTE), welcher den Photolyasen fehlt. Dieser CTE ist in CraCRY ca. 100 Aminosäuren lang und nicht in der Kristallstruktur enthalten. Um den CTE weiter zu analysieren wurde Wasserstoff-Deuterium-Austausch gekoppelt mit Massenspektrometrie durchgeführt und die unterschiedlichen Reduktionszustände miteinander verglichen. Die erhaltenen Ergebnisse decken zwar den CTE nicht vollständig ab, jedoch konnten klare Unterschiede zwischen den Reduktionszuständen festgestellt werden. Daraus können wir schließen, dass es durch die Bildung des Tyrosylradikals bei der Photoreduktion zur Umstrukturierung im Bereich der Tyr-Schleife sowie der C-terminalen α22-Helix kommt. Um die intramolekularen strukturellen Veränderungen durch die Photoreduktion und DNA-Reparatur weiter zu untersuchen, wurde zeitaufgelöste Röntgenstrukturanalyse am freien Elektronenlaser SACLA mit einer Klasse II CPD Photolyase (MmCPDII) und CraCRY durchgeführt. Dadurch war es möglich geworden die verschiedenen Konformationen des MmCPDII Flavinchromophors in seinen unterschiedlichen Oxidationszuständen zu zeigen. Diese Arbeiten legen den Grundstein dafür, dass der komplette Reparaturmechanismus der CPD sowie (6-4) Schäden durch zeitaufgelöste SFX aufgelöst werden kann.