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Entwicklung eines standardisierbaren Systems zum quantitativen Nachweis von DNAzym-Aktivität in vitro für den Einsatz in der Therapie des allergischen Asthma bronchiale
Allergisches Asthma bronchiale gehört zu den häufigsten chronisch-entzündlichen Erkrankungen in den industrialisierten Ländern. Die Betroffenen leiden unter einer Hyperreagibilität des Bronchialssytems, rezidivierender bronchialer Obstruktion und Entzündung und schließlich einem sogenannten “Airway...
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| 1. Verfasser: | |
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| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2018
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Allergisches Asthma bronchiale gehört zu den häufigsten chronisch-entzündlichen Erkrankungen in den industrialisierten Ländern. Die Betroffenen leiden unter einer Hyperreagibilität des Bronchialssytems, rezidivierender bronchialer Obstruktion und Entzündung und schließlich einem sogenannten “Airway Remodelling” mit irreversiblen strukturellen Veränderungen. Die Genese der Erkrankung ist multifaktoriell. Pathophysiologisch führt der Kontakt mit Allergenen zu einer Kaskade des Immunsystems, an deren Ende die Degranulation von Mastzellen mit massiver Freisetzung der Substanzen steht, welche die typische allergische Reaktion hervorrufen. Bei diesem Vorgang spielt ein Ungleichgewicht der T-Helferzellen mit Verschiebung zugunsten der Th2-Subpopulation eine entscheidende Rolle. Die Differenzierung in diese Richtung wird wesentlich durch den Transkriptionsfaktor GATA-3 vermittelt.
Bisher ist eine Therapie des allergischen Asthma bronchiale nur symptomatisch (z.B. mittels β2-Sympathomimetika oder Glukokortikoiden) möglich. Nicht nur aufgrund der teilweise signifikanten Nebenwirkungen dieser Substanzen besteht ein „medical need“ für kausale Therapieansätze. Diese aktuell noch bestehende Lücke könnte durch Antisense-Strategien ausgefüllt werden, die über eine Interferenz mit der mRNA eine anschließende Translation und damit Proteinüberexpression unterbinden sollen. DNAzyme beispielsweise binden an mRNA, um sie mittels inhärenter katalytischer Aktivität zu degradieren. Zum Zeitpunkt der experimentellen Phase dieser Dissertation existierte kein einfaches in vitro-Testsystem, mit dem man eine verlässliche Aussage zur Effizienz einzelner DNAzyme treffen kann.
Entsprechend sollten in der vorliegenden Arbeit zwei Testsysteme generiert und hinsichtlich ihrer Praxistauglichkeit verglichen werden. In beiden Fällen wurde als Modellsystem das DNAzym hgd40 verwendet, das in der Lage ist, die mRNA des Transkriptionsfaktors GATA-3 zu spalten. Dessen genetische Sequenz wurde zum einen in einen Vektor einkloniert, der zudem den Genabschnitt eines fluoreszierenden Proteins (mCherry) enthält. Zum anderen fand ein Reportergensystem Anwendung, das Genabschnitte für Luciferasen beinhaltet (Vektor psiCheck mit den Luciferasen Firefly und Renilla). Die Degradierung der GATA-3 mRNA durch hgd40 sollte eine Reduktion der Proteinexpression von mCherry und den Luciferasen bewirken, sodass über eine entsprechend verminderte Signaldetektion die Effizienz des DNAzyms messbar gemacht werden kann.
Letztendlich gelang es, entsprechende Expressionsvektoren zu konstruieren und mittels Transfektion in Zellen (HEK-293) einzubringen. Auch konnte eine erfolgreiche Transfektion der Zellen mit dem DNAzym gezeigt werden. Allerdings war nach Behandlung mit hgd40 keine Suppression des jeweiligen Signals messbar.
Die Gründe hierfür können vielfältig sein. Zunächst ist die Wahl der Zelllinie und des Transfektionsreagenz von großer Bedeutung, da Probleme beim Einbringen des DNAzyms in die Zellen oder der intrazellulären Freisetzung in passende Kompartimente auftreten können. Zudem spielt die Struktur der Ziel-mRNA eine entscheidende Rolle für eine erfolgreiche Interaktion. Auch kann die Expression der Zielstruktur durch intrazelluläre Faktoren oder Umwelteinflüsse behindert werden und es kann zu Hindernissen bei der Signaldetektion kommen. Zur Vermeidung der genannten Probleme wurden verschiedene Transfektionsprotokolle und Nachweismethoden ausgetestet.
Es wurde deutlich, dass jeder Schritt zur Erstellung eines derartigen Testsystems für DNAzyme komplikationsbehaftet ist und es weiterführender Untersuchungen bedarf. Auch wenn in keinem der beiden vorgestellten Ansätze eine Regulation durch das DNAzym gezeigt werden konnte, so waren bezüglich des Systems psiCheck-GATA-3 zumindest eine ausreichende Expression der Luciferasen und GATA-3 sowie eine intrazelluläre Aufnahme des DNAzyms nachweisbar. Insgesamt scheint dieses System demnach für nachfolgende Untersuchungen geeigneter. |
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| Umfang: | 129 Seiten |
| DOI: | 10.17192/z2019.0029 |