Characterisation and differentiation of kinase binding pockets in PKA and PIM1 by small molecule fragments using protein crystallography

Das primäre Ziel dieser Doktorarbeit war die kristallographische Untersuchung der beiden Kinasen Pim1 und PKA im Komplex mit kleinen Fragment-Molekülen, um ein mögliches Binden solcher Fragmente in den Proteinbindetaschen zu detektieren. In dem ersten größeren Teilprojekt dieser Arbeit wurden vor allem charakteristische Gemeinsamkeiten und Unterschiede zwischen den beiden Kinasen herausgestellt. Die Fragmente für diese Untersuchung stammten aus einer hauseigenen Bibliothek mit 361 Einträgen. Diese Fragmente wurde mittels einer Vorauswahl durch den Thermal Shift Assay auf ihre potentiellen Bindungseigenschaften an beide Kinasen untersucht. Diese Vorauswahl lieferte 31 potentielle Bindungs-Kandidaten für die PKA und in 52 für die Pim1. Die anschließende kristallographische Analyse dieser Treffer ergab, dass bei der PKA 15 Fragmente und bei der Pim1 13 gebunden hatten. Gemessen an den gesammelten Datensätzen für beide Proteine (31 PKA / 15 Pim1) ergab sich eine Trefferquote von 48% für die PKA und eine von 87% für die Pim1. Bedingt durch die Auswahl des Auswahlverfahrens und dem schwierigen Kristallisation-Verfahrens der Pim1-Kinase wurden lediglich drei der 361 Fragmente bei beiden Proteinen gemeinsam gefunden und dann kristallographisch untersucht. Lediglich das Fragment F222 wurde für beide Kinasen als Hit identifiziert. Der Bindungsmodus dieses Fragmentes ist bei beiden Proteinen sehr ähnlich. Dennoch verweist dieser Vergleich auf drei wesentliche Unterschiede in den ATP Bindetaschen, welche die Protein-Ligand-Interaktionen beeinflussen. Die Pim1 weist an der so genannten Hinge-Region Pro123 auf, wodurch ein Wasserstoffbrücken-Donor weniger in der Bindetasche zur Verfügung steht. Die PKA hat durch Thr183 eine weitere polare Seitenkette in der Bindetasche, wogegen die Pim1 dort ein hydrophobes Ile185 aufweist. Zusätzlich besitzt die PKA eine lange C-terminale Schleife, die an der Bindetasche entlang verläuft. Die Seitenkette des dort anliegenden Phe327 ragt aus dieser Schleife in die Bindetasche der PKA hinein, verringert dadurch das zur Verfügung stehende Volumen und verengt den Eingangsbereich. Diese markanten Unterschiede zeigen sich auch an einem leicht unterschiedlichem Bindemodus von F222 in beiden Kinasen. Der TSA hat als Vor-Testverfahren gezeigt, dass eine Anreicherung von kristallographischen Treffern bei den beiden Kinasen erreicht werden kann, da eine stichprobenartige kristallographische Analyse weiterer Kandidaten außerhalb der TSA-Trefferliste eine geringere Trefferquote von 20% aufzeigte. Ebenfalls deutet das Ergebnis der TSA-Analyse auf eine gewisse Selektivität der Fragmente zwischen PKA und Pim1 hin. Im Vergleich zu bereits publizierten PKA- und Pim1-Bindern konnten bekannte sowie neue Gruppierungen für die Proteininteraktionen detektiert werden. In dem zweiten größeren Teilprojekt dieser Arbeit wurde die PKA einer ausschließlich direkten röntgenkristallographischen Durchsuchung mit Fragmenten unterzogen. Eine Bibliothek von 96 Fragment-Verbindungen wurde mittels „Soaking“ auf dieser Kinase getestet. Von 96 gesammelten Datensätzen enthielten 30 einen kristallographisch bestätigten Binder. Dies entspricht einer Treffer-Quote von 31%. Dabei wurden 43 Fragmente einer PKI-gebundenen und 53 Fragmente einer PKI-freien Kristallform der PKA unterworfen. Die entdeckten 30 Treffer teilten sich hälftig in 15 Komplexe der PKI-haltigen und 15 Komplexe der PKI-freien Form auf. Es wurden 24 Fragmente gefunden, welche in der ATP Bindetasche gebunden hatten. Da einige Fragmente mehrfach aufgenommen wurden, konnten 15 Fragmente außerhalb dieser Tasche detektiert werden, sodass insgesamt 39 unterschiedliche Bindeposen detektiert wurden. Die Fragmente in der Bindetasche wurden je nach aufgetretenen Interaktionsmuster klassifiziert. Unterschieden wurde zwischen direkten (12) sowie Wasser-vermittelten (2) „Hinge“-Bindern bzw. direkten (16) oder Wasser-vermittelten (4) DFG-Schleifen-Bindern (4). Die außerhalb der ATP-Bindetasche bindenden Fragmente wurden hinsichtlich ihrer vergrabene Oberfläche mit weiteren in der Packung nahestehenden PKA Molekülen untersucht, um abzuklären, ob der beobachtete Bindungsmodus nur in der Festkörperpackung auftritt und unter Bedingungen in Lösung als Artefakt zu bezeichnen wäre. Insgesamt 5 dieser 15 Fragmente wiesen eine vergleichsweise hohe vergrabene Oberfläche mit Nachbar-Proteinmolekülen auf. Wegen der recht hohen Anzahl an Bindern in der ATP Bindetasche wurde eine topologische Auswertung dieser Tasche angefertigt, in der die detektierten Strukturelemente den verschiedenen Teilregionen dieser Tasche zugeordnet wurden. Im Vergleich mit einer anderen Fragment-basierten Studie aus der Saxty Gruppe an PKA/PKB fielen drei Fragmente aus der vorliegenden Untersuchung auf, die in Struktur und Bindungsmodus Ähnlichkeiten zu einem Inhibitor dieser Studie aufzeigten, der nM Binding aufweist. Diese drei Fragmente legen die Entwicklung eines „zusammengeführten-Liganden“ nahe. Im Laufe dieses Teilprojektes konnte eine neue Kristallform der PKA entwickelt werden, die ohne den Substratinhibitor PKI gewonnen wurde (s. oben). Diese PKA Kristalle zeichneten sich durch eine längere Wachstumsphase aber auch ein verbessertes Streuvermögen aus. Im Durchschnitt hatten die PKI-freien Strukturen eine verbesserte Auflösung von 0,25 Å. Zudem war bei diesen Kristallen die Peptid-Bindestelle zugänglich für Fragmente, was auch durch die Arg-ähnlichen Fragmente J72 und J77 genutzt wurde. Das dritte Teilprojekt dieser Arbeit umfasst einen Teil eines Kooperationsprojektes mit der AG Kolb und der AG Diederich. Hierbei wurden im ersten Schritt Fragment-Moleküle gesucht, die mit den Aminosäuren Glu121 und Lys67 der Pim1 Kinase interagieren. Geeignete Fragmente sollen mit weiteren Synthesebausteinen kombiniert werden, um eine Interaktion mit Asp128 und Glu171 zu erhalten. Für die virtuelle Trefferidentifikation wurde die Datenbank SCUBIDOO verwendet. Die Suche nach geeigneten Fragmenten resultierte in drei Verbindungen, die durch Docking, Ähnlichkeit-Untersuchungen und einer „FCFP4 fingerprint“ - Untersuchung der „Chembridge fragment library“ extrahiert wurden. Ein aufgefundenes Fragment wurde bereits 2012 von Good et. al. in Komplex mit Pim1 publiziert. Wir konnten mit unserem Verfahren dessen Auswahl und Bindung bestätigen und somit auch unser Verfahren auf dessen Funktionalität und Zuverlässigkeit überprüfen. Die Verbindung 4012413 wurde ebenfalls mit der Pim1 kristallisiert. Die resultierende Elektronendichte der vermessenen Kristallstruktur zeigte, dass die Verbindung vermutlich in der Bindetasche gebunden hatte. Allerdings war die Dichte aufgrund der schlechten Qualität des Datensatzes nicht ausreichend für eine zuverlässige Einpassung des Fragmentes. Durch die TSA-Analyse konnten ebenfalls Hinweise erhalten werden, die andeuten, dass die Fragmente an Pim1 binden. Eine erneute Kristallisation der Verbindungen 4012413 und 4012414 stehen in Aussicht. Das vierte Teilprojekt dieser Arbeit beschäftigt sich mit Verbindungen aus der ZINC Datenbank, welche als potentielle Binder der Pim1 Kinase durch Docking identifiziert wurden. Eine Auswahl von 6 Verbindungen zeigten einen vielversprechenden Bindungsmodus im Docking. Eine Analyse der Liganden im TSA hinsichtlich Pim1 ergab, dass mit einer Ausnahme alle Verbindungen einen stabilisierenden Effekt auf Pim1 nehmen. Drei dieser Verbindungen wurden kristallographisch getestet. Zwei zeigten eine Bindung an das Protein. Die Verbindung ZINC08880252 konnte nicht als Binder identifiziert werden und zeigte auch keinen stabilisierenden Effekt im TSA. Die beiden Verbindungen ZINC72154357 und ZINC09314085 ergaben kristallographisch einen anderen Bindungsmodus als in der Docking-Vorhersage. Die Verbindung ZINC09314085 wurde nur teilweise in der Differenzelektronendichte entdeckt. Die Gründe für dieses Verhalten werden im weiteren Fortgang des Projektes geklärt. Die Hydrolyse der zentralen Carbonsäure-Ester Verknüpfung der Verbindung wäre eine mögliche Erklärung. Auch kann der nicht charakterisierte Teil des Liganden ungeordnet oder mit hoher Restmobilität vorliegen und sich daher nicht in der Differenzelektronendichte abzeichnen. Um diese Ansätze zu verfolgen wurde der Ersatz der Esterbindung durch eine Amid-Gruppe, sowie eine massenspektroskopische Analyse initiiert.