Synthetic noise control in eukaryotic gene expression and signal transduction

A certain level of randomness is inherent to every biological process, causing individual cells in a clonally identical population to vary in the number of protein molecules. This variation that was termed gene expression noise arises from stochastic fluctuations and the variability of numbers and s...

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Main Author: Mundt, Max
Contributors: Sourjik, Victor (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2018
Biologie
Subjects:
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Table of Contents: Jedem biologischen Prozess wohnt eine Zufallskomponente inne. Während der Genexpression entsteht „Rauschen“ durch stochastische Fluktuationen und Schwankungen in der Anzahl und Aktivität der involvierten Expressionsmaschinerie. Daraus resultiert, dass sich Zellen einer genetisch identischen Population in der Zahl ihrer Proteine unterscheiden, was sich negativ auf biologische Prozesse auswirken kann. Evolutionär hat die Natur auf Mechanismen selektiert, die Rauschen vermindern und der zellulären Fitness zugutekommen. Die meisten synthetisch-biologischen genetischen Schaltkreise und Signaltransduktionswege verfügen allerdings nicht über Systeme, die Genexpressionsrauschen regulieren, wodurch ihre Funktionalität limitiert werden kann. In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein synthetisches System zur Kontrolle von Genexpressionsrauschen in der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Die präsentierten Daten wurden zum Großteil mittels Durchflusszytometrie aufgenommen mit einer Messkonfiguration, welche wir zuvor auf minimales unspezifisches biologisches und technisches Rauschen optimiert haben. Das von uns entwickelte System ermöglicht es die Variation in der Expression eines Zielgens einzustellen, indem dessen Transkriptionsrate und mRNA-Degradationsrate gesteuert werden. Dafür verwenden wir induzierbare Promotor- und Ribozym-Sequenzen. Messungen in denen wir einen Unterschied im Genexpressionsrauschen eines Fluoreszenzreporters um bis zu 300 % einstellen, demonstrieren die Funktionalität unseres Systems. Wir bewerten die Leistungsfähigkeit unseres „Noise Tuners“ indem wir ihn mit semi-synthetischen Systemen vergleichen, deren mRNA-Degradationsrate durch native Hefe-Terminatoren gesteuert wird. Wir verwenden ein analytisches Modell, welches Genexpression mit der Verteilung von Proteinkonzentrationen auf Populationsebene verbindet. Auf der Basis dieses Modells betreiben wir stochastische Simulationen, die die experimentellen Ergebnisse reproduzieren und einen tieferen Einblick in die zugrundeliegenden Mechanismen erlauben: Im gegebenen Parameterbereich wird der Grad des Rauschens von der Transkriptionsrate definiert, wohingegen die Expressionsniveaus sowohl von der Transkriptionsrate wie auch der mRNA-Degradationsrate gesteuert werden. Mit der Entwicklung des Noise Tuners verfolgen wir zwei Ziele: Zum einen die Reduktion von Genexpressionsrauschen in Systemen, in denen es sich als schädlich erweist; zum anderen wollen wir ihn als Werkzeug etablieren um den Einfluss von Rauschen in komplexeren Systemen zu untersuchen. Dazu testen wir den Noise Tuner für verschiedene Gene des Signaltransduktionswegs für die sexuelle Paarung in S. cerevisiae, einem Modellsignalweg für synthetisch-biologische Studien. Angewandt auf verschiedene Gene zeigen wir, dass der Noise Tuner das Rauschen in der Aktivität des Signaltransduktionswegs kontrollieren kann. Eine detaillierte Analyse zum negativen Regulator SST2 zeigt Unterschiede in der Variabilität des Signaltransduktionswegs von bis zu 50 %. Wir zeigen die physiologische Relevanz dieser Veränderung durch verbesserte Informationsweiterleitung, wenn SST2-Rauschen herabreguliert ist. Darüber hinaus untersuchen wir die Morphologien von ca. 10.000 Hefezellen und zeigen, dass Zellen mit niedrigem SST2-Rauschen bei Stimulation des Signalwegs präziser mit dem Paarungs-Phänotyp reagieren als Zellen mit verrauschter SST2-Genexpression. Des Weiteren untersuchten wir, ob die hier beschriebene und erfolgreich getestete Strategie zur Kontrolle von Variabilität in der Genexpression auch in natürlichen Genen gezeigt werden kann. Dazu wählten wir fünf Gene der Hefe aus, für die wir auf Basis publizierter Daten extrem hohe bzw. niedrige mRNA-Degradationsraten berechnet hatten. Wir nutzen die entsprechenden Promotoren und Terminatoren dieser Gene um das Genexpressionsrauschen in einem Reportergen zu messen und konnten einen generellen Trend feststellen für niedriges Rauschen bei hoher Transkriptions- und mRNA-Degradationsrate und genauso den umgekehrten Trend für hohes Rauschen bei niedrigen Raten. Für die zwei Gene mit der extremsten (hohen bzw. niedrigen) Variabilität konnten wir zudem Hinweise finden, die der Hypothese entsprechen, das Genexpressionsrauschen mit bestimmten Genfunktionen verknüpft ist. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir die Entwicklung, Konstruktion und erfolgreiche Anwendung eines synthetischen Werkzeugs zur Kontrolle des Expressionsrauschens von Genen. Die vorgestellten Ergebnisse illustrieren den Einfluss den das Genexpressionsrauschen einer individuellen Komponente eines Signaltransduktionswegs auf dessen Leistungsfähigkeit haben kann; wir zeigen aber auch, wie dieser Einfluss kontrolliert werden kann. Wir empfehlen, dass generelle Design-Prinzipien für niedrige Variabilität in der Genexpression - wie die hier vorgestellte Methode - verwendet werden um die Leistungsfähigkeit synthetischer Netzwerke zu verbessern.