Structure-function analysis of Cmu1, the secreted chorismate mutase from Ustilago maydis

Der Brandpilz Ustilago maydis gehört zu den Basidiomyceten und ist Erreger des Maisbeulenbrandes in Zea mays. Das U. maydis Genom kodiert für mehr als 400 sekretierte Effektoren Proteine. Die sekretierte U. maydis Chorismatmutase Cmu1 ist solch ein translozier Effektor. Dem Modell zufolge soll die Chorismatmutase Aktivität von Cmu1 im pflanzlichen Zytoplasma dazu führen, dass die Chorismatkonzentration in den Chloroplasten, wo Chorismat zur Synthese des pflanzlichen Abwehrhormons Salizylat (SA) herangezogen würde, gesenkt wird. Die Cmu1 Kristallstruktur zeigt, dass dieser Effektor im Vergleich zur zytoplasmatischen Chorismatmutase Aro7p von Saccharomyces cerevisiae besondere Merkmale besitzt: einen exponierten Bereich aus sauren Aminosäuren, eine Disulfidbrücke, eine putative Fettsäurebindestelle und eine Loop-Region. Diese Arbeit zeigt, dass durch zielgerichtete Mutagenese der sauren Oberflächenregion, der Disulfidbrücke und der putativen Fettsäurebindestelle funktionellen Proteine erzeugt wurden, die den Virulenzphänotyp des U. maydis Stammes CL13Δcmu1 komplementieren konnten. Nach Überexpression in E. coli gereinigtes Cmu1 Protein folgte in einem Chorismatmutase Aktivitätstest einer Michaelis-Menten Kinetik. Die Mutation der Fettsäurebindestelle hatte keinen Einfluss auf die Enzymkinetik von Cmu1. Ein U. maydis Dreifachdeletionsstamm, in welchem cmu1, das für die Isochorismatase codierende Gen um12021 und shy1, welches für eine Salizylat Hydroxylase codiert deletiert wurden, zeigte, im Gegensatz zu Stämmen in welchen diese Gene einzeln oder paarweise deletiert wurden, reduzierte Virulenz. Dies deutet darauf hin, dass diese drei Enzyme bei der Unterdrückung des SA Weges zusammenwirken. Durch Immunopräzipitation (IP) von Cmu1 aus infiziertem Gewebe und anschließender massenspektroskopischer Analyse konnte das Mais Protein Cmi1 (Cmu1 interactor 1) als Interaktionspartner identifiziert werden. Diese Interaktion konnte durch in vitro Pull-down Experimente bestätigt werden. Rekombinantes Cmi1 Protein inhibierte die Chorismatmutase Aktivität von Cmu1. Die Expression von cmi1 wird nach Infektion mit U. maydis stark hochreguliert, was für einen Zusammenhang zwischen Cmi1-Funktion und Pathogenität spricht. Mittels Wasserstoff-Deuterium-Austauschmessungen (HDX/MS) konnte die Loop-Region in Cmu1 als Interaktionsbereich identifiziert werden. Ein cmu1 Allel mit verkürzter Loop-Region, wodurch die Interaktion zwischen Cmu1 und Cmi1 unterbunden wurde, konnte den Virulenzdefekt von CL13Δcmu1 nur teilweise komplementieren. Dies könnte deutet darauf hindeuten, dass die Interaktion zwischen Cmu1 und Cmi1 für die Virulenz von U. maydis von Bedeutung ist.