Establishment and characterization of preclinical mouse models for evaluation of oncogenic and tumor-suppressive properties of p53 family members

Cancer development is a multistep process which leads to tumors composed of diverse cell populations originating from one cell which underwent differential genetic changes over time. Within one tumor, such heterogeneity provides distinct subpopulations with selection advantages promoting metastasis...

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Main Author: Fuchs, Jeannette
Contributors: Stiewe, Thorsten (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2016
Molekularbiologie und Tumorforschung
Subjects:
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Table of Contents: Die Tumorentwicklung ist ein mehrstufiger Prozess, bei dem sich aus einer einzigen Ursprungszelle durch Akkumulierung diverser Mutationen Tumoren entwickeln, die aus mehreren Populationen unterschiedlichen genetischen Status bestehen. Diese Heterogenität führt zu Selektionsvorteilen einzelner Subpopulationen innerhalb eines Tumors, die unter anderem Metastasierung sowie Therapieresistenz begünstigen. Zur Verbesserung der gezielten Krebstherapie von Patienten kann mittlerweile während des Therapieverlaufs die Zusammensetzung der Tumoren durch im Blut zirkulierende Tumor DNA verfolgt und die Therapie demensprechend angepasst werden. In experimentellen Ansätzen, wie Transplantationsmodellen solider Tumoren in Mäusen, kann diese Methode allerdings nicht angewandt werden, da das Blutvolumen der Versuchstiere zu klein ist. Dies limitiert die Untersuchung tumorrelevanter Faktoren in präklinischen Studien im Mausmodell. In dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, mit deren Hilfe die Wachstumsdynamiken zweier unterschiedlicher Zellpopulationen in einem einzigen Tumorzellimplantat simultan verfolgt werden können. Hierzu wurde vor der Transplantation jeweils eine Zellpopulation durch stabile Expression von Gaussia Luziferase (GLuc) oder Cypridina Luziferase (CLuc) markiert. Beide Luziferasen werden aus den Zellen sezerniert und ins Blut der Versuchstiere abgegeben. Kleinste Blutproben sind bereits ausreichend, um die Tumorkomposition mittels Messung der Enzymaktivität beider Luziferasen zu bestimmen. Um die Auswirkungen gezielter genetischer Manipulationen untersuchen zu können wurden die Luziferasen zusätzlich an (un)spezifische shRNAs gekoppelt. Zur Etablierung wurden shRNAs verwendet, die sich gegen die p53 Familienmitglieder p53 und p73 richten. Während p53 als der wichtigste Tumorsuppressor bekannt ist, gibt es von p73 zwei N-terminal unterschiedliche Isoformen, die entgegesetzte Funktionen besitzen: das ebenfalls tumorsuppressive TAp73 und das tumorfördernde Np73. Die dominant negative Wirkung von Np73 liegt unter anderem in der Komplexierung seiner Familienmitglieder p53 und TAp73, wodurch diese die Fähigkeit verlieren an ihre Zielgene zu binden. Durch Kopplung der Luziferasen an unspezifische bzw. experimentelle shRNAs konnte die unterschiedliche Wachstumsdynamik transplantierter Zellen in An- bzw. Abwesenheit von p53 (oder p73) simultan verfolgt werden. Die in dieser Arbeit etablierte Methode wurde sowohl in einem Modell der experimentellen Metastasierung als auch unter therapeutischen Bedingungen erfolgreich validiert. Darüberhinaus konnte gezeigt werden, dass das Wachstumsverhalten p73-hochexprimierender Hs 766T Zellen abhängig vom relativen Verhältnis beider N-terminaler Isoformen zueinander ist. Eine shRNA-vermittelte Reduktion beider Isoformen hemmt die Tumorigenität dieser Zellen. In Übereinstimmung mit dem aktuellen Wissensstand wurde dieser Effekt durch ektopische Expression von Np73 wieder aufgehoben, wohingegen die Wiedereinführung von TAp73 die Proliferation noch weiter reduzierte. Um die Rolle von Np73 während der Tumorentwicklung genauer zu untersuchen, wurde zudem ein induzierbares Np73-transgenes Mausmodell charakterisiert. Obwohl die alleinige Überexpression von Np73 keinen tumorigenen Effekt aufwies, führte die Kombination mit heterozygotem Verlust von p53 zu einer früheren und verstärkten Tumorentstehung, insbesondere von Lungentumoren und Lymphomen. Der Verlust des zweiten p53 Allels in den Lungentumoren lässt eher auf eine dominant negative Wirkung von Np73 auf TAp73 als auf p53 schließen. Auch die beobachteten Fertilitäts- und embryonalen Entwicklungsdefekte dieser transgenen Mäuse weisen vielmehr auf einen TAp73-abhängigen Effekt von Np73 hin, da im Gegensatz zu p53-defizienten Mäusen bereits ähnliche Defizite in TAp73- und gesamt-p73-defizienten Mäusen beschrieben wurden. Letztlich wurde durch die transkriptomweite Analyse Np73-überexprimierender muriner embryonaler Fibroblasten eine positive Regulation metastasierungsrelevanter Faktoren (ITGB4, JAG1, JAG2) festgestellt. Diese onkogene Eigenschaft von Np73 geht einher mit der Beobachtung dass Lymphome aus Np73;p53+/- Mäusen verstärkt in die Lungen disseminierten. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass Np73 sowohl wachstums- als auch metastasierungsfördernde Eigenschaften besitzt, die genauen Wirkungsmechanismen allerdings abhängig vom Zellkontext sind.