Encapsulation of desmopressin into hydrophobic nanoparticles and hydrophilic microparticles for pulmonary drug delivery

Die Dissertation besteht aus drei Elementen: der Einkapselung des Peptidwirkstoffs Desmopressin acetat in PLGA Nanopartikel (3.1), die Entwicklung einer Methode zur Herstellung von Mikropartikeln aus hydrophilen Polymeren (3.2) und der Einkapselung der PLGA Nanopartikel in eben diese hydrophilen Mikropartikel (3.3). Die PLGA Nanopartikel werden mit einer leicht modifizierten „Double Emulsion Solvent Diffusion“-Methode hergestellt. Die zentrale Änderung zu gängigen Ansätzen ist, dass vor der Emulgierung mit einer Ultraschall Sonde keine Durchmischung der beiden Phasen vorgenommen wurde und das organische Lösungsmittel nach der Herstellung durch Abzentrifugation der Partikel und Verwerfen des Überstands und nicht durch Verdampfen entfernt wurde (2.2.2). Die derart hergestellten Nanopartikel waren im Größenbereich zwischen 106 und 131 nm (hydrodynamischer Durchmesser) mit PDI < 0,1. Zetapotential und pH-Werte wurden ermittelt zwischen -38 und -44 mV und pH 5,5 und 5,9 (3.1.1). Die Beladung der Partikel wurde durch eine Doppelemulsion im ersten Schritt realisiert. Hierbei wurden unterschiedliche Stabilisatoren in der Primäremulsion getestet, um feststellen zu können, ob diese einen Einfluss auf die Einkapselung haben. Verglichen wurden alle Ergebnisse statistisch mit einer Kontrolle, in der lediglich die Oberfläche beschichtet war (keine Doppelemulsion). Es konnte hierbei gezeigt werden, dass es einen signifikanten Unterschied zwischen der Einkapselung unter Zuhilfenahme des Stabilisators Pluronic F-68 und dem Beschichtungsansatz gab. Des Weiteren war auch der Unterschied zwischen Pluronic F-68 und einer Kontrolle ohne Stabilisatoren (Doppelemulsion, aber Einkapselung ohne Stabilisator) signifikant unterschiedlich. Die beiden Kontrollen jedoch zeigten untereinander keinen signifikanten Unterschied in der Beladung, was den Schluss zulässt, dass für eine Einkapselung in die Partikel ein Stabilisator nötig ist. Die Beladungseffizienz war im besten Experiment (Pluronic F-68) hoch genug, um mit kommerziell erhältlichen Formulierungen mitzuhalten, die Einkapselungseffizienz allerdings war mit 6 bis 9% zu niedrig für eine sinnvolle Anwendung (3.1.3). Neben der quantitativen Analyse des Peptids mittels HPLC wurde auch mittels LC-MS geprüft, ob das Peptid durch die Einkapselung Schäden davonträgt, was verneint werden konnte (3.1.4). In einem weiteren Experiment wurden die PLGA Nanopartikel mit hLF-Peptid, einem Penetrationsverstärker, durch Inkubation beschichtet. Nach der Inkubation konnte gezeigt werden, dass das Peptid für mindestens 7 Tage stabil in wässriger Dispersion auf den Partikeln verbleibt. Neben der Beladung war auch eine Funktionalisierung der Partikel möglich (3.1.5). Im zweiten Teil wurde ein Transportsystem, primär für pulmonale Applikation entwickelt. Hierbei wurde besonderer Wert darauf gelegt, das System so flexibel wie möglich zu halten, um es über diese Dissertation hinaus auch für andere Anwendungen einsetzen zu können. Das erarbeitete System ist eine Abwandlung der „Emulsion Diffusion“-Methoden, anhand derer auch die PLGA Nanopartikel hergestellt wurden. Da sich die Phasen der Emulsion, die für die PLGA Nanopartikel eingesetzt wurden, aber nicht einfach vertauschen ließen, musste ein Zwischenschritt eingefügt werden, in dem die Emulsion in einem anderen Lösungsmittel als dem Präzipitationsmittel hergestellt wird (3.2). Das daraus entstehende Dreiphasensystem ist in der Lage, Partikel aus unterschiedlichen hydrophilen Polymeren (z.B.: Dextran, Chitosan, Alginat, Gelatine, Glucomannan und Lignin) herzustellen (3.2.3). Die Größen der Partikel, die mit dieser Methode hergestellt werden, lassen sich über die Größe der Emulsionstropfen steuern. Um möglichst homogene Emulsionen herzustellen, wurde eine Membranemulgierung eingesetzt, bei der die zu dispergierende Phase mehrfach eine Membran passierte und damit entsprechend der Porengröße der Membran in kleine Tropfen dispergiert wurde. Hierbei konnten Partikel aus Chitosan im Größenbereich um 500-600 nm hergestellt werden (3.2.1). Zur Vereinfachung und um schneller arbeiten zu können, wurde für einige Experimente die Emulsion mit einem Hochdruckhomogenisator hergestellt, oder es wurde bei der Membranemulgierung auf multiple Membranpassagen verzichtet. Neben der Herstellung wurde auch eine Trocknungsmethode entwickelt. Hierfür wurden die Partikel zunächst mit organischem Lösungsmittel von überschüssigem Stabilisator befreit und dann mit flüssigem Stickstoff in organischem Lösungsmittel eingefroren und daraus gefriergetrocknet (2.2.3). Derart getrocknete Partikel wiesen eine Lagerstabilität (in mit Luft gefüllten abgeschlossenen Gefäßen) von mindestens 11 Monaten auf. Einzig die Dextran Partikel wiesen nach 11 Monaten eine glattere Oberfläche auf, was auf ein Anlösen der Oberfläche in der Luftfeuchtigkeit hindeutet (3.2.3). Auch die direkte Einkapselung von Desmopressin in Dextranpartikel mittels dieser Methoden wurde getestet und führte zu deutlich höheren Einkapselungseffizienzen als bei PLGA Nanopartikeln (3.2.4). In einem weiteren Experiment wurde die Dextranlösung vor der Emulgierung mit Pluronic F-127 gemischt. Diese Mischung führte zu einer Phasentrennung zweier wässriger Phasen. Dieser Effekt konnte genutzt werden, um poröse Partikel herzustellen, indem beide Phasen vor der Emulgierung gut durchmischt wurden und dann gemeinsam emulgiert und präzipitiert wurden. Die daraus entstehenden Partikel bestanden aus zwei festen Phasen, von denen eine durch ein organisches Lösungsmittel ausgewaschen werden konnte. Die resultierenden Partikel hatten Löcher und waren porös (3.2.2). Im dritten Teil wurden dann erneut PLGA Nanopartikel hergestellt aus einem Fluoresceinamin-gelabelten PLGA. Diese Nanopartikel wurden in Dextranpartikel eingekapselt und mittels Konfokalmikroskopie untersucht. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dass sich PLGA Nanopartikel in Dextranpartikel einkapseln lassen (3.3). Ein flexibles hydrophiles Trägersystem zum Transport beladener und funktionalisierter hydrophober Nanopartikel konnte erfolgreich hergestellt werden.